Ahora es posible detectar la actividad de las herramientas de edición de genes CRISPR en organismos a simple vista y una linterna ultravioleta utilizando tecnología desarrollada en el Laboratorio Nacional de Oak Ridge del Departamento de Energía.
Los científicos demostraron estas herramientas de detección en tiempo real en plantas y anticipan su uso en animales, bacterias y hongos con diversas aplicaciones para biotecnología, bioseguridad, bioenergía y agricultura. El equipo describió el exitoso desarrollo del sistema UV en Investigación en horticultura y su demostración de prueba de principio en Biología sintética ACS .
Las tecnologías CRISPR se han convertido rápidamente en las herramientas principales de la bioingeniería y continuamente se están desarrollando nuevas versiones. Identificar si un organismo ha sido modificado por la tecnología CRISPR era anteriormente un proceso complejo y que requería mucho tiempo.
"Antes de esto, la única forma de saber si se produjo la ingeniería del genoma era mediante un análisis forense", dijo Paul Abraham, químico bioanalítico y jefe del Área de Enfoque de Ingeniería de Ecosistemas Seguros y Ciencia del Diseño de ORNL.necesitamos saber cómo era el genoma antes de que se reescribiera. Queríamos diseñar una plataforma donde pudiéramos observar de forma proactiva la actividad CRISPR ".
El equipo de investigación desarrolló una solución de autodetección eficiente que aprovecha la forma en que CRISPR funciona para activar la tecnología para que se revele. En condiciones normales, CRISPR funciona conectándose con una secuencia corta de ARN, conocida como ARN guía, ya quelleva a CRISPR a una secuencia de ADN coincidente. Cuando se encuentra el ADN objetivo, CRISPR modifica el ADN actuando como pequeñas tijeras moleculares para cortar una o ambas hebras de ADN, según el tipo de tecnología CRISPR en uso.
Abraham compara su método con un sistema de alarma con dos componentes: un ARN guía biosensor que redirige la actividad CRISPR y una proteína informadora que marca la actividad. Los investigadores codifican los dos componentes en el ADN de un organismo para habilitar el sistema de monitoreo.
Con el sistema de autodetección en su lugar, el ARN guía del biosensor intercepta CRISPR, lo que evita que CRISPR se conecte con su gen objetivo original y redirija CRISPR a una secuencia de ADN específica que codifica una proteína verde fluorescente que no funciona, o GFP. Cuando CRISPR editala secuencia, acciona un interruptor que produce GFP en funcionamiento, que crea un brillo verde que indica la presencia de CRISPR.
Debido a que se requiere un microscopio para ver el brillo de GFP, los investigadores mejoraron su método original al reemplazar GFP con una proteína informadora similar, llamada eYGFPuv, que es visible bajo el tipo de luz ultravioleta comúnmente conocida como luz negra.
"Ahora podemos ver si CRISPR está activo en tiempo real sin importar el tamaño, la forma y la ubicación de los organismos que estamos evaluando", dijo Abraham. "Esta flexibilidad acelera el proceso de bioingeniería y extiende el uso de los biosensores en laboratorio yaplicaciones de campo. "
Dado que CRISPR debe adaptarse a cada organismo para un uso eficaz, saber si la tecnología CRISPR está funcionando en una planta o microbio en particular puede acelerar el progreso hacia objetivos como el desarrollo de cultivos bioenergéticos resistentes a la sequía y la ingeniería de bacterias para convertir de manera eficiente las plantas en aviación sostenible.combustibles.
"Estas herramientas nos permiten identificar rápidamente los transformantes positivos con los cambios genéticos deseados a los que nos dirigimos", dijo Carrie Eckert, líder del Grupo de Biología Sintética de ORNL. "Podemos ver fácilmente las variantes frente a aquellas en las que no se produjo la modificación".
Los biosensores también proporcionan un método eficaz para saber si CRISPR sigue activo después de que las modificaciones deseadas hayan surtido efecto. Xiaohan Yang, biólogo sintético de plantas de ORNL y coautor, compara la actividad de edición del genoma de CRISPR con una cirugía beneficiosa, pero advierte que "no"No quiero que el cirujano deje atrás las tijeras "ya que la actividad CRISPR continua podría tener efectos no deseados.
Yang prevé aplicaciones de biosensores que podrían probar la progenie de plantas modificadas, por ejemplo, para verificar que la maquinaria de edición de genes no se transfirió a ellas. Con esta tecnología, es posible estudiar un campo completo de cultivos.
El equipo de investigación creó biosensores específicos para detectar varias herramientas CRISPR, incluida la nucleasa Cas9, el editor principal, el editor base y CRISPRa. Demostraron los sensores individualmente con cada sensor que indica la presencia de un tipo particular de herramienta CRISPR. Abraham también ve el potencialpara combinar los biosensores en una versión que marcaría múltiples tecnologías de edición de genes a la vez.
"Continuaremos optimizando estos biosensores para mejorar la seguridad de las biotecnologías de próxima generación", dijo Abraham.
Los colaboradores del artículo titulado "Expandiendo la aplicación de un reportero UV-visible para expresiones genéticas transitorias y transformación estable en plantas" incluyen a Guoliang Yuan, Haiwei Lu, Md. Mahmudul Hassan, Jin-Gui Chen, Gerald Tuskan y Xiaohan Yang de ORNL, así como Dan Tang y Yi Li de la Universidad de Connecticut.
Los científicos detallaron su demostración de prueba de principio en Biología sintética ACS . Los coautores del artículo, "Biosensores basados en plantas para detectar la edición del genoma mediada por CRISPR", incluyen a Guoliang Yuan de ORNL, Md. Mahmudul Hassan, Tao Yao, Haiwei Lu, Michael Vergara, Wellington Muchero, Jin-Gui Chen, Gerald Tuskan, Paul Abraham, Xiaohan Yang y Jesse Labbe ahora en Invaio Sciences, así como Changtian Pan y Yiping Qi de la Universidad de Maryland.
La investigación fue apoyada por el Center for Bioenergy Innovation y el Secure Ecosystem Engineering and Design Science Focus Area, ambos financiados por el programa de Investigación Biológica y Ambiental de la Oficina de Ciencias del DOE. La Fundación Nacional de Ciencias proporcionó apoyo adicional.
Los biosensores detectan la actividad CRISPR, video : http://www.youtube.com/watch?v=mYvFyksphp8
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