Para identificar nuevos objetivos terapéuticos potenciales para el SARS-CoV-2, un equipo de científicos del Centro del Genoma de Nueva York, la Universidad de Nueva York y la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, realizó una pérdida defunción de la pantalla CRISPR para eliminar sistemáticamente todos los genes del genoma humano. El equipo examinó qué modificaciones genéticas hacen que las células pulmonares humanas sean más resistentes a la infección por SARS-CoV-2. Sus hallazgos revelaron genes individuales y redes reguladoras de genes en el genoma humano que son requeridos porSARS-CoV-2 y que confieren resistencia a la infección viral cuando se suprimen. El estudio colaborativo describió una amplia gama de genes que no se habían considerado previamente como dianas terapéuticas para el SARS-CoV-2. Su estudio fue publicado en línea por celda el 24 de octubre
Para comprender mejor las complejas relaciones entre las dependencias genéticas del huésped y el virus, el equipo utilizó una amplia gama de métodos analíticos y experimentales para validar sus resultados. Este enfoque integrador incluyó la edición del genoma, la secuenciación de una sola célula, la obtención de imágenes confocales yanálisis de la expresión génica y conjuntos de datos proteómicos. Los investigadores encontraron que estos nuevos objetivos genéticos, cuando se inhiben mediante el uso de moléculas pequeñas fármacos, reducen significativamente la carga viral y, con algunos fármacos, hasta 1.000 veces. Sus hallazgos ofrecen información sobre nuevas terapias quepuede ser eficaz en el tratamiento de COVID-19 y revelar los objetivos moleculares subyacentes de esas terapias.
"Al ver el trágico impacto de COVID-19 aquí en Nueva York y en todo el mundo, sentimos que podíamos usar las herramientas de edición de genes CRISPR de alto rendimiento que hemos aplicado a otras enfermedades para comprender cuáles son los genes humanos clave necesariospor el virus SARS-CoV-2 ", dijo el coautor principal del estudio, el Dr. Neville Sanjana, miembro principal de la facultad del Centro del Genoma de Nueva York, profesor asistente de biología de la Universidad de Nueva York y profesor asistente de neurociencia y fisiología enNYU Grossman School of Medicine. Anteriormente, el Dr. Sanjana aplicó pantallas CRISPR en todo el genoma para identificar los impulsores genéticos de diversas enfermedades, incluida la resistencia a los medicamentos en el melanoma, el fracaso de la inmunoterapia, la metástasis del cáncer de pulmón, la inmunidad innata, los trastornos metabólicos innatos y la distrofia muscular..
Para este proyecto, la edición del genoma era solo la mitad de la ecuación. "Anteriormente, desarrollamos una serie de modelos de células humanas para la infección por coronavirus en nuestro trabajo para comprender las respuestas inmunitarias al virus. Fue genial formar un equipo con el grupo de Nevillepara comprender y perfilar de manera integral los genes del huésped desde un nuevo ángulo ", dijo el coautor principal, el Dr. Benjamin tenOever, profesor de medicina Fishberg, académico Icahn y profesor de microbiología, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai.
Los grupos de genes marcan el camino
El equipo descubrió que los genes mejor clasificados, aquellos cuya pérdida reduce sustancialmente la infección viral, se agruparon en un puñado de complejos de proteínas, incluidas ATPasas vacuolares, Retromer, Commander, Arp2 / 3 y PI3K. Muchos de estos complejos de proteínasparticipan en el tráfico de proteínas hacia y desde la membrana celular.
"Nos complació mucho ver varios genes dentro de la misma familia como éxitos mejor clasificados en nuestra pantalla de genoma completo. Esto nos dio un alto grado de confianza en que estas familias de proteínas eran cruciales para el ciclo de vida del virus, ya sea para entrar encélulas humanas o una replicación viral exitosa ", dijo el Dr. Zharko Daniloski, becario postdoctoral en el Laboratorio Sanjana y coautor principal del estudio.
Mientras que los investigadores realizaron el cribado CRISPR utilizando células pulmonares humanas, el equipo también exploró si la expresión de los genes del huésped requeridos era específica de pulmón o se expresaba de manera más amplia. Entre los genes mejor clasificados, solo ACE2, el receptor que se sabe que es responsable deque se unió a la proteína viral del SARS-CoV-2 Spike, mostró una expresión específica de tejido, con el resto de los impactos genéticos superiores ampliamente expresados en muchos tejidos, lo que sugiere que estos mecanismos pueden funcionar independientemente del tipo de célula o tejido. Usando datos proteómicos, encontraronque varios de los genes del huésped mejor clasificados interactúan directamente con las propias proteínas del virus, destacando su papel central en el ciclo de vida viral. El equipo también analizó los genes del huésped comunes necesarios para otros patógenos virales, como el Zika o la influenza pandémica H1N1.
Conocimientos mecanicistas: colesterol y receptores virales
Después de completar la detección primaria, el grupo de investigadores utilizó varias técnicas diferentes para validar el papel de muchos de los genes mejor clasificados en la infección viral. Utilizando líneas celulares humanas derivadas del pulmón y otros órganos susceptibles al SARS-CoV-2infección, midieron la infección viral después de la desactivación de genes por CRISPR, la supresión de genes mediante la interferencia de ARN o la inhibición de fármacos. Después de validar que estas manipulaciones reducían la infección viral, luego buscaron comprender los mecanismos por los cuales la pérdida de estos genes bloquea la infección por coronavirus.
Utilizando una tecnología desarrollada recientemente que combina la edición CRISPR a gran escala con la secuenciación de ARN unicelular ECCITE-seq, el equipo identificó que la pérdida de varios genes de alto rango da como resultado una regulación positiva de las vías de biosíntesis del colesterol y un aumento encolesterol celular. Con este conocimiento, estudiaron los efectos de la amlodipina, un fármaco que altera los niveles de colesterol.
"Encontramos que la amlodipina, un antagonista de los canales de calcio, regula al alza los niveles de colesterol celular y bloquea la infección por SARS-CoV-2. Dado que los estudios clínicos recientes también han sugerido que los pacientes que toman bloqueadores de los canales de calcio tienen una tasa de letalidad reducida de COVID-19, una importante dirección de investigación futura será esclarecer aún más la relación entre las vías de síntesis del colesterol y el SARS-CoV-2 ", dijo el Dr. Tristan Jordan, becario postdoctoral en tenOever Lab y co-primer autor del estudio.
Sobre la base de trabajos anteriores sobre mutaciones en la proteína Spike y la entrada viral a través del receptor ACE2, el equipo de investigación también preguntó si la pérdida de algunos genes podría conferir resistencia al coronavirus al reducir los niveles de ACE2. Identificaron un gen en particular, RAB7A,que tiene un gran impacto en el tráfico de ACE2 a la membrana celular. Usando una combinación de citometría de flujo y microscopía confocal, el equipo demostró que la pérdida de RAB7A evita la entrada viral al secuestrar los receptores ACE2 dentro de las células.
"Los tratamientos actuales para la infección por SARS-CoV-2 persiguen al virus en sí, pero este estudio ofrece una mejor comprensión de cómo los genes del huésped influyen en la entrada viral y permitirá nuevas vías para el descubrimiento terapéutico y, con suerte, acelerará la recuperación de las poblaciones susceptibles".dijo el Dr. Sanjana.
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Materiales proporcionado por Centro del genoma de Nueva York . Nota: el contenido se puede editar por estilo y longitud.
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