Un nuevo estudio realizado por el profesor de microbiología G. William Arends en la Universidad de Illinois Bill Metcalf con el becario postdoctoral Dipti Nayak ha documentado el uso de la edición del genoma mediada por CRISPR-Cas9 en el tercer dominio de la vida, Archaea, por primera vez.Su trabajo pionero, informado en Actas de la Academia Nacional de Ciencias , tiene el potencial de acelerar enormemente los estudios futuros de estos organismos, con implicaciones para la investigación, incluido el cambio climático global. Metcalf y Nayak son miembros del Instituto Carl R. Woese de Biología Genómica en Illinois.
"En la mayoría de circunstancias, nuestro modelo de arqueón Methanosarcina acetivorans , tiene un tiempo de duplicación de ocho a diez horas, en comparación con E. coli, que puede duplicarse en aproximadamente 30 minutos. Lo que eso significa es que hacer genética, obtener un mutante, puede llevar meses; lo mismo tomaríatres días en E. coli , "explica Nayak." Lo que CRISPR-Cas9 nos permite hacer, a un nivel muy básico, es acelerar todo el proceso. Elimina un cuello de botella importante ... al hacer investigación genética con este arqueón.
"Aún más", continúa Nayak, "con nuestras técnicas anteriores, las mutaciones tenían que introducirse paso a paso. Con esta nueva tecnología, podemos introducir múltiples mutaciones al mismo tiempo. Podemos ampliar el proceso de mutacióngeneración exponencialmente con CRISPR. "
CRISPR, abreviatura de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, comenzó como un sistema de defensa inmune en arqueas y bacterias. Al identificar y almacenar fragmentos cortos de ADN extraño, las proteínas Cas sistema asociado a CRISPR pueden identificar rápidamente ese ADN enel futuro, para que luego pueda ser destruido rápidamente, protegiendo al organismo de la invasión viral.
Desde su descubrimiento, se ha modificado una versión de este sistema inmunológico, CRISPR-Cas9, para editar genomas en el laboratorio. Al emparejar Cas9 con una guía de ARN diseñada específicamente en lugar de un fragmento de ADN invasivo, el sistema CRISPR puedeestar dirigido a cortar el genoma de una célula en una ubicación arbitraria de modo que los genes existentes se puedan eliminar o agregar nuevos. Este sistema ha sido prolíficamente útil en la edición de sistemas eucariotas de levadura, plantas, peces e incluso células humanas, lo que le valió laEl premio Breakthrough of the Year 2015 de la Association for the Advancement of Science. Sin embargo, su implementación en especies procarióticas se ha enfrentado a obstáculos, debido en parte a sus diferentes procesos celulares.
Para usar CRISPR en un sistema celular, los investigadores deben desarrollar un protocolo que tenga en cuenta el mecanismo de reparación del ADN preferido de una célula: después de que las "tijeras moleculares" de CRISPR cortan el cromosoma, el sistema de reparación de la célula interviene para reparar el daño a través de unmecanismo que se puede aprovechar para eliminar o agregar material genético adicional. En las células eucariotas, esto toma la forma de unión de extremos no homólogos NHEJ. Aunque esta vía se ha utilizado para la edición mediada por CRISPR, tiene la tendencia de introducir elementos genéticoserrores durante su proceso de reparación: los nucleótidos, los peldaños de la escalera de ADN, a menudo se agregan o eliminan en el sitio de corte.
NHEJ es muy poco común en procariotas, incluida Archaea; en cambio, su ADN se repara más a menudo a través de un proceso conocido como reparación dirigida por homología. Al comparar el daño con una plantilla de ADN, la reparación dirigida por homología crea lo que Nayak llama un "deterministaplantilla ": el resultado final se puede predecir de antemano y adaptar a las necesidades exactas del investigador.
En muchos sentidos, la reparación dirigida por homología es en realidad preferible para la edición del genoma: "Por mucho que queramos que CRISPR-Cas9 realice ediciones dirigidas en sistemas eucariotas, a menudo terminamos con cosas que no queremos, debido a NHEJ", explica Nayak." En este sentido, fue bueno que la mayoría de las cepas de arqueas no tengan un sistema de reparación de unión de extremos no homólogo, por lo que la única forma en que se puede reparar el ADN es a través de esta ruta de reparación homóloga determinista ".
Aunque pueda parecer contrario a la intuición, uno de los primeros usos de CRISPR-Cas9 de Nayak y Metcalf fue introducir un mecanismo NHEJ en Methanosarcina acetivorans. Aunque generalmente no es preferible para la edición del genoma, dice Nayak, NHEJ tiene un uso para el que es superiora la reparación homóloga: "Si solo desea eliminar un gen, si no le importa cómo ... la unión de extremos no homólogos es en realidad más eficiente".
Al utilizar el sistema de reparación NHEJ introducido para realizar lo que se conoce como estudios "knock-out", en los que se elimina o silencia un solo gen para ver qué cambios se producen y qué procesos podría afectar ese gen, Nayak dice que la investigación futuraser capaz de ensamblar un atlas genético de M. acetivorans y otras especies de arqueas. Tal atlas sería increíblemente útil para una variedad de campos de investigación relacionados con Archaea, incluida un área de particular interés para el laboratorio de Metcalf, el cambio climático.
"Methanosarcina acetivorans es una de las cepas de arqueas más tratables genéticamente", dice Nayak. "[Los metanógenos son] una clase de arqueas que producen gigatoneladas de este potente gas de efecto invernadero cada año, juegan un papel clave en el ciclo global del carbono,y por lo tanto contribuir significativamente al cambio climático global ". Al estudiar la genética de este y otros organismos similares, Nayak y Metcalf esperan obtener no solo una comprensión más profunda de la genética de las arqueas, sino también de su papel en procesos ambientales más amplios.
En general, esta investigación representa una nueva dirección emocionante en el estudio y manipulación de las arqueas. "Comenzamos esta investigación para determinar si el uso de la edición del genoma CRISPR-Cas9 en arqueas era posible", concluye Nayak. "Lo que hemos descubiertoes que no solo es posible, sino que funciona muy bien, incluso en comparación con los sistemas eucariotas ".
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Materiales proporcionado por Instituto Carl R. Woese de Biología Genómica, Universidad de Illinois en Urbana-Champaign . Nota: el contenido se puede editar por estilo y longitud.
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