Para lograr el objetivo de erradicar la malaria establecido por el Programa Mundial de Control de la Malaria de la Organización Mundial de la Salud OMS, es fundamental que se elimine toda transmisión local de parásitos de la malaria en áreas geográficas definidas. Una piedra angular importante en este camino es ladesarrollo de capacidades de diagnóstico rápidas, sensibles y específicas de especies que sean útiles en los entornos de bajos recursos LRS de muchas áreas con malaria endémica.
Actualmente, la presencia de las cuatro especies principales de Plasmodium causantes de paludismo, P. falciparum, P. vivax, P. ovale y P. malariae, se determina mediante análisis microscópico de muestras de sangre en las que se pueden detectar parásitos en los glóbulos rojos,o con las llamadas pruebas de diagnóstico rápido para proteínas específicas de Plasmodium antígenos.
"Desafortunadamente, los métodos de diagnóstico rápido disponibles no pueden distinguir las cuatro especies de Plasmodium entre sí, lo que puede ser importante para iniciar el tratamiento definitivo y, lo que es más importante, son ineficaces para detectar un número reducido de parásitos de Plasmodium en individuos asintomáticos,", dijo Nira Pollock, MD, Ph.D., Directora Médica Asociada del Laboratorio de Diagnóstico de Enfermedades Infecciosas del Boston Children's Hospital y Profesora Asociada de Patología y Medicina en la Facultad de Medicina de Harvard." Estos "portadores asintomáticos" son reservorios silenciosos para la transmisión continua de la malaria.propaga mosquitos y es extremadamente importante para los esfuerzos mundiales en curso para erradicar la malaria ", agregó Jeffrey Dvorin, MD, Ph.D., profesor asociado de pediatría en la Escuela de Medicina de Harvard y médico asociado senior en enfermedades infecciosas en el Boston Children's Hospital.
Ahora, una colaboración de investigación multidisciplinaria que fue dirigida por el miembro de la Facultad de Wyss Core James Collins, Ph.D. en el Instituto Wyss de Ingeniería Biológicamente Inspirada de Harvard y el Instituto de Tecnología de Massachusetts MIT, y reunido por el compañero clínico Rose Lee, MD, MSPH, que también incluía a Pollock y Dvorin, creó un ensayo de diagnóstico ultrasensible y aplicable en el campo que detecta específicamente secuencias de ADN de todas las especies de Plasmodium en casos de paludismo sintomático y asintomático. El nuevo método de diagnóstico del paludismo combina una preparación rápida de muestras optimizada de 10 minutosprotocolo con el sistema SHERLOCK basado en CRISPR para permitir la detección de Plasmodium altamente específica y sensible en otros 60 minutos en dispositivos informadores simples. Se publica en PNAS.
"Este ensayo de diagnóstico de paludismo SHERLOCK listo en el campo supera los requisitos de sensibilidad y especificidad establecidos por la OMS para una prueba deseada que se puede utilizar para detectar una baja densidad de parásitos en portadores asintomáticos de todas las principales especies de Plasmodium", dijo el miembro de la Facultad Fundadora de Wyss.James Collins, Ph.D. "Su diseño altamente optimizado podría proporcionar una solución viable al actual cuello de botella de diagnóstico en el camino para eliminar la malaria y, de manera más general, permitir la vigilancia de la malaria en entornos de bajos recursos". Collins es un líder de Living del InstitutoÁrea de Enfoque de Dispositivos Celulares, y también el Profesor Termeer de Ingeniería Médica y Ciencia en el MIT.
El equipo de investigación demostró que su ensayo SHERLOCK abreviatura de Desbloqueo de reportero enzimático específico de alta sensibilidad diseñado es capaz de detectar menos de dos parásitos por microlitro de sangre, el "límite de detección" LOD sugerido por la OMS para una prueba conamplia utilidad en áreas endémicas. Demostrando el potencial clínico del ensayo mediante el análisis de muestras clínicas que contienen especies de P. falciparum y P. vivax, las identificaron con 100% de sensibilidad, identificando correctamente muestras positivas verdaderas, y 100% de especificidad, también correctamenteidentificar muestras que carecen de una determinada especie de Plasmodium en muestras verdaderas negativas. Cerca del 100% de sensibilidad y especificidad son atributos clave de los ensayos de diagnóstico que se utilizarán en las pruebas del mundo real. Además, el ensayo está diseñado para que también pueda determinar la presencia de mutaciones frecuentesCepas de P. falciparum que han perdido su antígeno HRP2 y, por lo tanto, escapan a la detección mediante pruebas de diagnóstico rápido comunes.
El grupo de Collins en el Wyss Institute y el MIT co-desarrollaron la tecnología SHERLOCK con el grupo de Feng Zhang en el Broad Institute. Se le otorgó la licencia a Sherlock Biosciences, una startup que la utilizó para crear un diagnóstico molecular rápido para otras aplicaciones de enfermedades, yrecibió recientemente una autorización de uso de emergencia de la FDA para su diagnóstico rápido de COVID-19.
Se han desarrollado otros métodos que, como el nuevo ensayo SHERLOCK, amplifican y detectan el material de ácido nucleico de ADN o ARN de especies de Plasmodium. Sin embargo, hasta la fecha, estos métodos siguen estando limitados por la necesidad de equipos de laboratorio costosos, como enel caso de los métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa PCR, las técnicas complicadas de preparación de muestras y el personal capacitado o, como en el caso de los métodos de amplificación "isotérmica" más simples realizados a una sola temperatura, no han mostrado las sensibilidades deseadas en el campo.
El ensayo de malaria SHERLOCK aprovecha la enzima CRISPR-Cas12a que se puede programar para que se active con un denominado ARN guía que se une a una secuencia diana de ácido nucleico diana específica, en este caso una secuencia de uno de los cuatro PlasmodiumCas12a activado luego escinde de manera no específica cualquier hebra de ADN monocatenario en su vecindad con una tasa de rotación extremadamente alta de aproximadamente 1250 reacciones de escisión colaterales por segundo. Los investigadores aprovecharon esta actividad amplificadora en su ensayo integrándola con unpreparación de la muestra, que no requiere un paso específico de extracción de nucleicos como algunas otras pruebas de amplificación de ácidos nucleicos NAAT, y amplificación isotérmica de secuencias específicas de ADN y ARN de Plasmodium en el extremo frontal. ARN guía que reconocen motivos específicos de especie en el Plasmodium amplificadoLas secuencias desencadenan la actividad de Cas12a, que ataca colateralmente a las secuencias informadoras de ADN monocatenario cuyos productos de escisión ayudanseñalar la presencia de ácidos nucleicos específicos de patógenos.En la parte final del ensayo, la señal está diseñada para provocar un cambio en la fluorescencia en un dispositivo portátil o una banda específica en una tira de flujo lateral que se usa comúnmente en dispositivos clínicos de punto de atención.
"Es importante destacar que el ensayo es compatible con diferentes tipos de muestras, como sangre total, plasma, suero y sangre seca, y todos los componentes necesarios para la amplificación, la activación de Cas12a y la generación de señales se pueden liofilizar en un solo tubo de ensayo para trabajar juntosen una reacción de un solo recipiente después de que se reconstituyen y se mezclan con la muestra del paciente ", dijo la primera autora Rose Lee, miembro clínica del grupo de Collins y del Boston Children's Hospital con un gran interés en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y fue fundamental en el ensamblaje deequipo multidisciplinario junto con Collins. "Esto evita tener que depender de una cadena de frío funcional y permite que las pruebas se realicen en entornos de bajos recursos con una experiencia mínima".
"El ensayo molecular de la colaboración para el diagnóstico de la malaria señala el camino en el que las capacidades del Wyss Institute en el campo de la biología sintética, cuando se combinan con la experiencia en biología y epidemiología de enfermedades infecciosas, podrían cambiar el curso de enfermedades verdaderamente debilitantes que paralizan a grandes poblaciones de todo el mundo", dijo el director fundador del Wyss Institute, Don Ingber, MD, Ph.D., quien también es profesor de Biología Vascular Judah Folkman en la Escuela de Medicina de Harvard y el Hospital de Niños de Boston, y profesor de Bioingeniería en la Escuela de Harvard John A. Paulson deIngeniería y Ciencias Aplicadas.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica en Harvard . Original escrito por Benjamin Boettner. Nota: el contenido se puede editar por estilo y longitud.
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