Un equipo de científicos que incluye investigadores del National Synchrotron Light Source II NSLS-II, una instalación para usuarios de la Oficina de ciencia del Departamento de Energía de EE. UU. En el Laboratorio Nacional Brookhaven del DOE, ha demostrado una nueva técnica para obtener imágenes de proteínasen 3-D con resolución a nanoescala. Su trabajo, publicado en Revista de la Sociedad Química Estadounidense , permite a los investigadores identificar la ubicación precisa de las proteínas dentro de las células individuales, alcanzando la resolución de la membrana celular y los orgánulos subcelulares más pequeños.
"En el mundo de la biología estructural, los científicos usan técnicas como la cristalografía de rayos X y la microscopía crioelectrónica para aprender sobre la estructura precisa de las proteínas e inferir sus funciones, pero no sabemos dónde funcionan en una célula", dijoLisa Miller, autora correspondiente y científica de NSLS-II. "Si estás estudiando una enfermedad en particular, necesitas saber si una proteína está funcionando en el lugar equivocado o no funciona".
La nueva técnica desarrollada por Miller y sus colegas es similar en estilo a los métodos tradicionales de microscopía de fluorescencia en biología, en los que una molécula llamada proteína verde fluorescente GFP puede unirse a otras proteínas para revelar su ubicación. Cuando se expone GFPa la luz ultravioleta o visible, emite un color verde brillante, iluminando una proteína que de otro modo sería "invisible" en la célula.
"Usando GFP, podemos ver si una proteína está en estructuras subcelulares que tienen un tamaño de cientos de nanómetros, como el núcleo o el citoplasma", dijo Miller, "pero estructuras como una membrana celular, que tiene solo siete a 10 nanómetrosde tamaño, son difíciles de ver con etiquetas de luz visible como GFP. Para ver estructuras del tamaño de 10 nanómetros en una celda, se beneficia enormemente del uso de rayos X ".
Para superar este desafío, los investigadores de NSLS-II se asociaron con científicos del Instituto de Tecnología de Massachusetts MIT y la Universidad de Boston BU que desarrollaron una etiqueta sensible a los rayos X llamada etiqueta de unión a lantánidos LBT.Los LBT son proteínas muy pequeñas que pueden unirse estrechamente a elementos de la serie de los lantánidos, como el erbio y el europio.
"A diferencia de la GFP, que emite fluorescencia cuando se expone a la luz ultravioleta o visible, los lantánidos lo hacen en presencia de rayos X", dijo la autora principal, Tiffany Victor, investigadora asociada de NSLS-II. "Y dado que los lantánidos no se encuentran naturalmente enla célula, cuando las vemos con el microscopio de rayos X, sabemos la ubicación de nuestra proteína de interés ".
Los investigadores de NSLS-II, MIT y BU trabajaron juntos para combinar la tecnología LBT con la fluorescencia de rayos X.
"Aunque los LBT se han utilizado ampliamente durante la última década, nunca se han utilizado para estudios de fluorescencia de rayos X", dijo Miller.
Más allá de obtener imágenes de mayor resolución, la fluorescencia de rayos X proporciona simultáneamente imágenes químicas de todos los oligoelementos en una célula, como calcio, potasio, hierro, cobre y zinc. En otros estudios, el equipo de Miller está investigando cómo los oligoelementos como el cobreestán relacionados con la muerte de neuronas en enfermedades como el Alzheimer. Visualizar la ubicación de estos elementos en relación con proteínas específicas será clave para nuevos hallazgos.
Además de su compatibilidad con los rayos X, los LBT también son beneficiosos por su tamaño relativamente pequeño, en comparación con las etiquetas de luz visible.
"Imagina que tienes una cola del tamaño de todo tu cuerpo, o más grande", dijo Miller. "Habría muchas actividades normales que ya no podrías hacer. Pero sisolo tenía que caminar con una pequeña cola de cerdo, aún podía correr, saltar y pasar por las puertas. GFP es como la cola grande: puede ser un impedimento real para la función de muchas proteínas. Pero estos pequeños lantánidos ...las etiquetas de enlace son casi invisibles ".
Para demostrar el uso de LBT para obtener imágenes de proteínas en 3-D con resolución a nanoescala, los investigadores de MIT y BU marcaron dos proteínas en una célula bacteriana: una proteína citoplasmática y una proteína de membrana. Luego, el equipo de Miller estudió la muestra enla línea de luz Hard X-ray Nanoprobe HXN en NSLS-II y la línea de luz Bionanoprobe en Advanced Photon Source APS, una instalación para usuarios de la Oficina de Ciencias del DOE en el Laboratorio Nacional Argonne del DOE.
"HXN ofrece el tamaño de foco de rayos X líder en el mundo, que se reduce a aproximadamente 12 nanómetros. Esto fue fundamental para obtener imágenes de la célula bacteriana en 3-D con resolución a nanoescala", dijo Yong Chu, científico principal de la línea de luz en HXN."También desarrollamos una nueva forma de montar las celdas en un portamuestras especializado para optimizar la eficiencia de las mediciones".
Al acoplar la resolución incomparable de HXN con las capacidades de los LBT, el equipo pudo obtener imágenes de ambas proteínas etiquetadas. Al visualizar la proteína de la membrana celular, se demostró que los LBT se pueden ver a alta resolución, mientras que las imágenes de la proteína citoplásmica mostraron que los LBTtambién se visualizará dentro de la celda.
"En altas concentraciones, los lantánidos son tóxicos para las células", dijo Víctor, "por lo que era importante para nosotros demostrar que podíamos tratar células con una concentración muy baja de lantánidos que no era tóxica y era lo suficientemente sustancial como para pasar la membrana celulare imágenes de las proteínas que queríamos ver ".
Ahora, con esta nueva técnica demostrada con éxito, los científicos esperan poder usar LBT para obtener imágenes de otras proteínas dentro de la célula a una resolución de 10 nanómetros.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por DOE / Laboratorio Nacional Brookhaven . Nota: el contenido se puede editar por estilo y longitud.
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