El uso de rayos X para revelar las estructuras tridimensionales de proteínas a escala atómica ha llevado a innumerables avances en la comprensión de cómo funcionan estas moléculas en bacterias, virus, plantas y humanos, y ha guiado el desarrollo de medicamentos de precisión para combatirenfermedades como el cáncer y el SIDA. Pero muchas proteínas no pueden convertirse en cristales lo suficientemente grandes como para descifrar sus disposiciones atómicas. Para abordar este desafío, los científicos del Laboratorio Nacional Brookhaven del Departamento de Energía de EE. UU. DOE y sus colegas de la Universidad de Columbiahan desarrollado un nuevo enfoque para resolver estructuras de proteínas a partir de pequeños cristales.
El método se basa en enfoques únicos de manejo de muestras, extracción de señales y ensamblaje de datos, y una línea de haz capaz de enfocar rayos X intensos en la Fuente de Luz Sincrotrón Nacional II NSLS-II de Brookhaven - una Oficina de Ciencia del DOEinstalación de usuario: a un lugar de la millonésima parte de un metro, aproximadamente una quincuagésima parte del ancho de un cabello humano.
"Nuestra técnica realmente abre la puerta a tratar con microcristales que antes eran inaccesibles, incluidos los receptores de superficie celular difíciles de cristalizar y otras proteínas de membrana, proteínas flexibles y muchas proteínas humanas complejas", dijo el científico de Brookhaven Lab, Qun Liu, el autor correspondiente del estudio, que se publicó el 3 de mayo de 2019 en IUCrJ , una revista de la Unión Internacional de Cristalografía.
descifrando estructuras de proteínas
La cristalografía de proteínas ha sido un método dominante para resolver estructuras de proteínas desde 1958, mejorando con el tiempo a medida que las fuentes de rayos X se han vuelto más poderosas, permitiendo determinaciones de estructuras más precisas. Para determinar una estructura de proteínas, los científicos miden cómo se generan los rayos X como los generadosen NSLS-II difractan, o rebotan, los átomos en una red cristalina ordenada que consiste en muchas copias de la misma molécula de proteína, todos dispuestos de la misma manera. El patrón de difracción transmite información sobre dónde se encuentran los átomos. Pero no es suficiente.
"Solo las amplitudes de las 'ondas' de rayos X difractadas se registran en el detector, pero no sus fases el tiempo entre ondas", dijo Liu. "Ambas son necesarias para reconstruir una estructura tridimensional. Esta es lallamado problema de la fase cristalográfica "
Los cristalógrafos han resuelto este problema mediante la recopilación de datos de fase de un tipo diferente de dispersión, conocida como dispersión anómala. La dispersión anómala ocurre cuando los átomos más pesados que los componentes principales de una proteína de carbono, hidrógeno y nitrógeno absorben y reemiten parte de la x-rays. Esto sucede cuando la energía de rayos X está cerca de la energía que a los átomos pesados les gusta absorber. Los científicos a veces insertan artificialmente átomos pesados como el selenio o el platino en la proteína para este propósito. Pero los átomos de azufre, que aparecen naturalmente en la proteínalas moléculas también pueden producir tales señales, aunque más débiles. A pesar de que estas señales anómalas son débiles, un cristal grande generalmente tiene suficientes copias de la proteína con suficientes átomos de azufre para que sean medibles. Eso les da a los científicos la información de fase necesaria para determinar la ubicación delos átomos de azufre y traducen los patrones de difracción en una estructura tridimensional completa.
"Una vez que conoce las posiciones de azufre, puede calcular las fases para los otros átomos de proteína porque la relación entre el azufre y los otros átomos es fija", dijo Liu.
Pero los cristales pequeños, por definición, no tienen tantas copias de la proteína de interés. Entonces, en lugar de buscar información de difracción y fase de copias repetidas de una proteína en un solo cristal grande, el equipo de Brookhaven / Columbia desarrolló unforma de tomar medidas de muchos cristales pequeños y luego reunir los datos colectivos.
pequeños cristales, grandes resultados
Para manejar los pequeños cristales, el equipo desarrolló cuadrículas de muestra modeladas con pocillos de tamaño micro. Después de verter el disolvente que contiene los microcristales sobre estas cuadrículas de montaje en pozo, los científicos eliminaron el disolvente y congelaron los cristales que quedaron atrapados en las cuadrículas.
"Sin embargo, todavía tenemos un desafío, porque no podemos ver dónde están los pequeños cristales en nuestra cuadrícula", dijo Liu. "Para averiguarlo, utilizamos microdifracción en la línea de haz de Cristalografía Macromolecular de Microfocalización Fronteriza FMX de NSLS-II"para examinar toda la cuadrícula. Escaneando línea por línea, podemos encontrar dónde están escondidos esos cristales "
Como explicó Martin Fuchs, el científico líder de la línea de luz de FMX, "La línea de luz de FMX puede enfocar la intensidad completa del rayo de rayos X a un tamaño de una micra, o millonésima parte de un metro. Podemos controlar finamente el rayotamaño para que coincida con el tamaño de los cristales: cinco micras en el caso del experimento actual. Estas capacidades son cruciales para obtener la mejor señal ", dijo.
Wuxian Shi, otro científico de la línea de luz FMX, señaló que "los datos recopilados en la encuesta de la cuadrícula contienen información sobre la ubicación de los cristales. Además, también podemos ver qué tan bien difracta cada cristal, lo que nos permite elegir solo los mejores cristalespara la recopilación de datos "
Los científicos pudieron maniobrar el soporte de la muestra para colocar cada microcristales de interés mapeados nuevamente en el centro del haz de rayos X de precisión para la recolección de datos.
Utilizaron la energía más baja disponible en la línea de luz, ajustada para acercarse lo más posible a la energía de absorción de los átomos de azufre, y recopilaron datos de dispersión anómalos.
"La mayoría de las líneas de haz cristalográficas no pudieron alcanzar el borde de absorción de azufre para señales anómalas optimizadas", dijo el coautor Wayne Hendrickson, de la Universidad de Columbia. "Afortunadamente, NSLS-II es una fuente de luz sincrotrón líder en el mundo que proporciona rayos X brillantes que cubren unamplio espectro de energía de rayos X. Y aunque nuestro nivel de energía estaba ligeramente por encima de la energía de absorción ideal para el azufre, generó las señales anómalas que necesitábamos ".
Pero los científicos aún tenían mucho trabajo por hacer para extraer esas señales importantes y reunir los datos de muchos cristales diminutos.
"En realidad estamos obteniendo miles de datos", dijo Liu. "Utilizamos alrededor de 1400 microcristales, cada uno con su propio conjunto de datos. Tenemos que reunir todos los datos de esos microcristales".
También tuvieron que eliminar datos de cristales que fueron dañados por los rayos X intensos o tenían ligeras variaciones en los arreglos atómicos.
"Un solo microcristal no difracta los rayos X lo suficiente para la solución de la estructura antes de ser dañado por los rayos X", dijo Sean McSweeney, subdirector de la división de fotones y gerente de programa del Programa de Biología Estructural en NSLS-II ".es particularmente cierto con cristales de solo unas pocas micras, del tamaño de una célula bacteriana. Necesitábamos una forma de explicar ese daño y la variabilidad de la estructura cristalina para que no sesgara nuestros resultados ".
Lograron estos objetivos con un sofisticado proceso de flujo de trabajo de varios pasos que analizó los datos, descartó valores atípicos que podrían haber sido causados por daños por radiación o cristales incompatibles, y finalmente extrajeron las señales de dispersión anómalas.
"Este es un paso crítico", dijo Liu. "Desarrollamos un procedimiento informático para asegurar que solo los datos compatibles se fusionaran de manera de alinear los microcristales individuales de los patrones de difracción. Eso nos dio las relaciones requeridas de señal a ruidopara determinar la estructura "
Aplicando la técnica
Esta técnica se puede utilizar para determinar la estructura de cualquier proteína que haya resultado difícil de cristalizar en un gran tamaño. Estos incluyen receptores de la superficie celular que permiten que las células de formas de vida avanzadas, como los animales y las plantas, detecten y respondan al entorno.liberando hormonas, transmitiendo señales nerviosas o secretando compuestos asociados con el crecimiento celular y la inmunidad.
"Para adaptarse al medio ambiente a través de la evolución, estas proteínas son maleables y tienen muchas modificaciones no uniformes", dijo Liu. "Es difícil obtener muchas copias repetidas en un cristal porque no se embalan bien".
En los humanos, los receptores son objetivos comunes para las drogas, por lo que tener conocimiento de sus estructuras variadas podría ayudar a guiar el desarrollo de nuevos productos farmacéuticos más específicos.
Pero la técnica no se limita solo a pequeños cristales.
"El método que desarrollamos puede manejar pequeños cristales de proteínas, pero también se puede usar para cristales de proteínas de cualquier tamaño, en cualquier momento que necesite combinar datos de más de una muestra", dijo Liu.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por DOE / Laboratorio Nacional Brookhaven . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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