Los investigadores de la Universidad de Rice han desarrollado un modelo computacional para cuantificar el mecanismo por el cual las proteínas CRISPR-Cas9 encuentran sus objetivos de edición del genoma.
Anatoly Kolomeisky, profesor de química e ingeniería química y biomolecular de Rice, y el alumno Alexey Shvets adaptaron un sistema que desarrollaron antes para mostrar cómo las proteínas generalmente encuentran sus objetivos biológicos. Esperan que el modelo revisado ayude a descubrir los misterios restantes de CRISPR.
En su estado natural, CRISPR, que significa "repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente y espaciadas regularmente", es el mecanismo biológico por el cual las bacterias se protegen de las infecciones virales. Las bacterias incorporan una copia del ADN extraño y crean un registro de todas esasque invaden. Se refieren a ese registro cuando se detectan nuevos invasores y lo usan para destruirlos.
En los últimos años, los investigadores han comenzado a adaptar el mecanismo para su uso en la edición del genoma, que tiene el potencial de curar enfermedades y mejorar organismos, incluidos los humanos. Pero un obstáculo ha sido el riesgo de que las proteínas CRISPR-Cas9, una de lasLos sistemas que utilizan el enfoque CRISPR, cortarán y reemplazarán las secuencias objetivo equivocadas, introduciendo mutaciones.
El modelo de Rice descrito en el Revista biofísica descubrió que es probable que CRISPR-Cas9 localice buenos objetivos de manera más eficiente cuando se permite que se realicen estas ediciones fuera del objetivo, porque las proteínas no pierden el tiempo disociándose de los objetivos fuera de objetivo para continuar buscando.
Eso puede o no ser algo bueno, pero ciertamente es digno de estudio, dijo Kolomeisky.
"La tasa de error corte fuera del objetivo a veces es del 10-20 por ciento", dijo. "Tenemos dos ideas sobre esto: una es que los virus mutan muy rápido y tal vez las bacterias están tratando de cortar objetivos que son solo un pocomutado como una forma de ser más flexible. La otra es que hay proteínas que pueden corregir errores, por lo que si no hay muchos cortes incorrectos, el sistema puede tolerarlos.
"Lo que viene de nuestro modelo es que creemos que el corte fuera del objetivo realmente puede ayudar a que el corte dentro del objetivo sea más rápido"
Kolomeisky dijo que su modelo es un simple paso para descubrir la dinámica de la edición CRISPR. "CRISPR-Cas9 es la variación más popular porque tiene solo una proteína y es más fácil, biológicamente, trabajar", dijo.
El laboratorio de Rice desarrolló su modelo original para aprender cómo las proteínas se deslizan a lo largo del ADN para encontrar objetivos y desencadenar procesos como la transcripción de genes. Kolomeisky señaló que la pionera de CRISPR Jennifer Doudna descubrió que CRISPR-Cas9 no busca de la misma manera ".no se deslice a ninguna parte del ADN ", dijo.
En cambio, según Doudna y su equipo, la proteína inicialmente reconoce secuencias PAM de tres nucleótidos para motivo adyacente protospacer que marcan la ubicación de objetivos potenciales ". CRISPR encuentra y se une a PAM y luego su ARN asociado explora el ADN adyacentepara ver si este es el objetivo ", dijo Kolomeisky." Si lo es, la proteína comienza a cortar. Si no, se disocia y mira a otra parte ".
En los experimentos posteriores de Doudna con las secuencias PAM eliminadas, las proteínas CRISPR-Cas9 no pudieron encontrar sus objetivos en absoluto. Por lo tanto, las PAM tienen un papel importante y no son solo un espaciador genérico, dijo. "Tan pronto como leí esto, entendípodríamos usar nuestro modelo aquí también "
El modelo teórico analiza los procesos de primer paso, aquellos que ocurren cuando un sistema cruza un umbral físico o químico, como encontrar un PAM relevante, para rastrear las proteínas CRISPR-Cas9 insertadas en una célula cuando primero examinan las secuencias PAM yluego, mientras está unido a los PAM, busque el objetivo de ADN que coincida con el ARN de Cas9.
Descubrieron que los CRISPR que evitan los recortes fuera del objetivo al disociarse del ADN "incorrecto" tardan más en establecerse que uno que simplemente corta los objetivos ". Ir al PAM incorrecto lleva tiempo", dijo Kolomeisky. "Nuestro cálculo muestra que CRISPR puedeencuentre objetivos reales más rápido cuando a veces corta en los lugares equivocados. La fracción que va a los objetivos correctos puede ser más pequeña, pero eventualmente los cortará.
"Es un modelo simple y exactamente solucionable", dijo Kolomeisky. "Si alguien quiere probar, el modelo puede proporcionar predicciones específicas y, en algunos casos, ofrecer tendencias para lo que debe observarse". Lo que falta del modelo es la capacidadpara ver si la clave de ARN reconoce su objetivo simultáneamente, uniéndose al ADN de una vez, o secuencialmente, nucleótido por nucleótido.
"Lo más impresionante de CRISPR no es el descubrimiento de un sistema inmune en bacterias sino el hecho de que esto ha creado una revolución en biotecnología, porque significa que en cualquier célula podemos cortar cualquier ADN en una ubicación específica, con mucha precisión", Dijo Kolomeisky." Espero que nuestro trabajo estimule estudios más fundamentales, porque me gusta mucho el método CRISPR. Pero no estoy contento cuando la gente lo aplica sin comprender cómo funciona a nivel molecular ".
Shvets es ahora un investigador postdoctoral en el Instituto de Tecnología de Massachusetts. Kolomeisky es profesor de química y de ingeniería química y biomolecular.
La Fundación Welch, la Fundación Nacional de Ciencias y el Centro de Física Biológica Teórica de Rice apoyaron la investigación.
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Materiales proporcionado por Universidad de Rice . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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