Se ha desarrollado un método novedoso para mejorar la purificación de proteínas complejas de alto rendimiento, alta pureza y alta actividad entre 10 y 500 veces en la Universidad de Alabama en Birmingham.
"Este nuevo método ofrece una serie de ventajas cruciales tanto para los investigadores como para la industria farmacéutica", dijo Dmitry Vassylyev, profesor de bioquímica y genética molecular en la UAB. "Es potencialmente la herramienta más eficiente y universal para estudios de alto rendimiento demuchos sistemas biológicos importantes y pueden ayudar a la producción a gran escala de proteínas terapéuticas ".
La purificación de alto rendimiento, alta pureza y alta actividad, o HHH, es el Santo Grial para aplicaciones estructurales e industriales. El esquema de purificación de un solo paso de la UAB supera las debilidades significativas de los actuales sistemas de purificación disponibles comercialmente, dice Vassylyev.
en un artículo publicado en Actas de la Academia Nacional de Ciencias , Vassylyev y sus colegas de la UAB probaron su método de purificación por cromatografía de afinidad CL7 / Im7 en cinco moléculas biológicas tradicionalmente desafiantes, incluidas las proteínas de membrana procariotas y eucariotas y las proteínas de unión de ADN / ARN de múltiples subunidades.
"Una ilustración notable del rendimiento superior del enfoque CL7 / Im7", escribieron en el informe de PNAS, "es que la muestra de proteína CNX, que purificamos en unas pocas horas y con solo unos pocos gramos de E. colicélulas, tendrían un valor de mercado de aproximadamente $ 400,000, de acuerdo con los precios comerciales actuales ".
El sistema es simple y reutilizable: los investigadores de la UAB han restaurado y reutilizado su columna de cromatografía de afinidad más de 100 veces, manteniendo una capacidad de unión de casi el 100 por ciento.
El método se basa en la afinidad de unión notablemente fuerte entre las toxinas bacterianas llamadas colicinas y sus proteínas de inmunidad específicas. Una bacteria huésped puede liberar una toxina colicina, como Colicin E7 DNAse, que puede matar otras bacterias. Dentro del huéspedbacterias, el CE7 se une con la proteína de inmunidad 7, o Im7; esta unión evita la destrucción autoinfligida.
La afinidad de unión de CE7 / Im7 es casi tan fuerte como un enlace covalente, y es de cuatro a siete órdenes de magnitud más alta que otros análogos de cromatografía de afinidad. Vassylyev y sus colegas hicieron una variante inactiva de CE7, llamada CL7, que no tieneLa actividad de DNasa, pero conserva una afinidad de unión completa por Im7. También hicieron una variante de Im7 que permite un acoplamiento eficiente a las perlas de agarosa.
Usando técnicas genéticas, la etiqueta CL7 se inserta fácilmente en genes de proteínas diana, tanto en eucariotas como en procariotas. Estos genes se pueden mover a un vector de expresión, o la proteína objetivo marcada se puede expresar desde las células nativas sin amplificación.
Cuando se vierte un lisado de proteína cruda a través de una columna llena con las perlas de agarosa Im7, las etiquetas CL7 en la proteína objetivo se unen a la Im7. Se utiliza un sitio de proteasa diseñado para liberar la proteína objetivo de la etiqueta CL7 unida.permite la purificación de HHH en un solo paso, con una pureza del 97 al 100 por ciento, para las proteínas objetivo probadas por los investigadores de la UAB.
En contraste, la mayoría de los esquemas de purificación publicados para estas proteínas desafiantes son protocolos de varios pasos y de varios días, con rendimientos más bajos. Vassylyev, un cristalogógrafo de proteínas, dice que obtener grandes cantidades de proteína pura es el paso limitante en la cristalografía, lo que lo lleva a comenzar unbusca un método mejor hace cuatro años.
Las proteínas desafiantes purificadas en el informe PNAS fueron la ARN polimerasa bacteriana Thermus thermophilus y la ARN polimerasa Mycobacteria tuberculosis, que son proteínas de múltiples subunidades; la integrasa de membrana YidC, una proteína de membrana Bacillus halodurans; calnexina, o CNX, una proteína chaperona transmembrana humana; y dosproteínas de unión a ácido nucleico, el complejo de proteína de condensina multisubunidad de Salmonella typhimurium que pliega y compacta el ADN celular, y el complejo de factor de remodelación y espaciamiento humano, RSF, que está implicado en la mediación del ensamblaje de nucleosomas.
El sistema de purificación simple también es aplicable a experimentos desplegables y actividad cinética o ensayos de unión, como la resonancia de plasmones de superficie. También puede ayudar a la microscopía crioelectrónica.
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Materiales proporcionado por Universidad de Alabama en Birmingham . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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