La investigación del profesor de Ingeniería Química y Biomolecular Huimin Zhao y la estudiante de posgrado Behnam Enghiad en la Universidad de Illinois es pionera en un nuevo método de ingeniería genética para la investigación y medicina biológica básica y aplicada. Su trabajo, reportado en Biología Sintética ACS el 6 de febrero [DOI: 10.1021 / acssynbio.6b00324], tiene el potencial de abrir nuevas puertas en la investigación genómica al mejorar la precisión y la adherencia del ADN en rodajas.
"Usando nuestra tecnología, podemos crear enzimas de restricción artificiales altamente activas con prácticamente cualquier especificidad de secuencia y extremos adhesivos definidos de longitud variable", dijo Zhao, quien dirige un grupo de investigación de biología sintética en el Instituto Carl R. Woese de Biología Genómica enIllinois. "Este es un raro ejemplo en biotecnología donde una función o reactivo biológico deseado puede diseñarse fácil y precisamente de manera racional".
Las enzimas de restricción son una herramienta importante en la investigación genómica: al cortar el ADN en un sitio específico, crean un espacio en el que se puede introducir ADN extraño para fines de edición de genes. Este proceso no solo se logra mediante enzimas de restricción naturales; otrosLas enzimas de restricción artificial, o ARE, han alcanzado prominencia en los últimos años. CRISPR-Cas9, un sistema inmune bacteriano utilizado para la edición de genes de "cortar y pegar", y TALEN, enzimas de restricción modificadas, son dos ejemplos populares de tales técnicas.
Aunque es útil en ingeniería genética, ningún ARE genera "extremos pegajosos" definidos: una ruptura desigual en la estructura de escalera de ADN que deja salientes complementarios, mejorando la adhesión al introducir ADN nuevo ". Si puede cortar dos muestras de ADN diferentes con elmisma enzima de restricción, los extremos adhesivos que se generan son complementarios ", explicó Enghiad." Se hibridarán entre sí, y si usa una ligasa, puede unirlos ".
Sin embargo, las enzimas de restricción en sí mismas tienen un inconveniente crítico: la secuencia de reconocimiento que les induce a cortar es muy corta, generalmente solo de cuatro a ocho pares de bases. Debido a que las enzimas cortarán en cualquier lugar donde aparezca esa secuencia, los investigadores confían en encontrar una enzima de restriccióncuyo sitio de corte aparece solo una vez en el genoma de su organismo o plásmido, una propuesta a menudo difícil cuando el ADN en cuestión podría tener miles de pares de bases de largo.
Este problema se ha resuelto parcialmente simplemente por la gran cantidad de enzimas de restricción descubiertas: se han caracterizado más de 3600 y más de 250 están disponibles comercialmente. "Solo en nuestro congelador, para nuestra otra investigación, probablemente tenemos más de 100 restricciones diferentesenzimas ", dijo Enghiad." Las revisamos todas cuando queremos reunir algo ... la posibilidad de encontrar el sitio de restricción único es muy baja.
"Nuestra nueva tecnología unifica todas esas enzimas de restricción en un solo sistema que consta de una proteína y dos guías de ADN. No solo las ha reemplazado, sino que ahora puede apuntar a sitios que no pueden tener las enzimas de restricción disponibles"
La nueva técnica de Enghiad y Zhao crea AREs mediante el uso de una proteína Argonaute PfAgo tomada de Pyrococcus furiosus , una especie arqueológica. Dirigida por una guía de ADN, PfAgo es capaz de reconocer secuencias mucho más largas al encontrar su sitio de corte, aumentando la especificidad y eliminando gran parte de los obstáculos planteados por las enzimas de restricción. Además, PfAgo puede crear extremos adhesivos más largos que inclusoenzimas de restricción, un beneficio sustancial en comparación con otras ARE.
"Cuando comenzamos, me inspiró un artículo sobre una proteína relacionada: TtAgo. Podría usar una guía de ADN para escindir el ADN, pero solo hasta 70 grados", explicó Enghiad. "Las cadenas de ADN comienzan a separarse más de 75grados, lo que podría permitir que una proteína cree extremos adhesivos. Si hubiera una proteína que fuera activa a temperaturas más altas, razoné, esa proteína podría usarse como una enzima de restricción artificial.
"Entonces comencé a buscar eso, y lo que encontré fue PfAgo"
Además de reemplazar las enzimas de restricción en los procesos de ingeniería genética, Enghiad y Zhao creen que su tecnología tendrá amplias aplicaciones en la investigación biológica. Al crear extremos adhesivos arbitrarios, PfAgo podría facilitar el ensamblaje de grandes moléculas de ADN y permitir la clonación de ADN grandemoléculas como vías bioquímicas y genes grandes.
La aplicación de estas técnicas es de gran alcance: desde el descubrimiento de nuevos fármacos de molécula pequeña hasta la ingeniería de fábricas de células microbianas para la síntesis de combustibles y productos químicos, hasta el diagnóstico molecular de enfermedades genéticas y patógenos, que son las áreas en las que Zhao y Enghiad se encuentran actualmenteexplorador.
"Debido a su simplicidad y programabilidad sin precedentes una sola proteína más guías de ADN para la selección, así como la accesibilidad ... esperamos que las ARE basadas en PfAgo se conviertan en una herramienta poderosa e indispensable en todas las enzimas de restricción o biotecnología habilitada con nucleasasaplicaciones e investigación biológica fundamental ", dijo Zhao." Es para la biología molecular como la tecnología CRISPR es para la biología celular ".
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Materiales proporcionado por Instituto Carl R. Woese de Biología Genómica, Universidad de Illinois en Urbana-Champaign . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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