Los científicos del Instituto de Investigación Scripps TSRI han desarrollado un nuevo y poderoso método para encontrar candidatos a fármacos que se unan a proteínas específicas.
El nuevo método, reportado en la edición de esta semana de Naturaleza , es un avance significativo porque puede aplicarse a un gran conjunto de proteínas a la vez, incluso a las miles de proteínas distintas directamente en su entorno celular nativo. Los investigadores de TSRI demostraron la técnica para encontrar "ligandos" socios de uniónpara muchas proteínas que anteriormente se pensaba que se unían mal a moléculas pequeñas que pueden usarse para determinar las funciones de sus objetivos proteicos y pueden servir como compuestos de partida para el desarrollo de fármacos.
Entre los ligandos recién descubiertos se encuentran los inhibidores selectivos de dos enzimas caspasas, que tienen funciones clave en múltiples enfermedades pero han eludido en gran medida los esfuerzos para atacarlos con medicamentos.
"Nuestros datos sugieren que el proteoma humano es mucho más ampliamente direccionable con moléculas pequeñas de lo que se ha apreciado anteriormente", dijo el investigador principal Benjamin F. Cravatt, presidente del Departamento de Fisiología Química y miembro del Centro de Neurociencia Dorris e Instituto Skaggspara Chemical Biology en TSRI: "Eso abre nuevas posibilidades para desarrollar sondas científicas y, en última instancia, fármacos".
Poniendo Fragmentos para Usar
Los investigadores han buscado durante mucho tiempo mejores formas de identificar ligandos de moléculas pequeñas para proteínas humanas y determinar qué proteínas en nuestras células son inherentemente "ligables". Los biólogos generalmente han utilizado algoritmos informáticos complejos para predecir si una clase determinada de proteínas puede unirse adecuadamente amoléculas pequeñas. Los investigadores farmacéuticos a menudo ni siquiera intentan desarrollar medicamentos para atacar proteínas que se consideran no responsables. Se cree que varias clases de proteínas grandes pertenecen a esta categoría, y hasta ahora solo 600 de las aproximadamente 20,000 proteínas humanas han sido atacadas con éxitocon medicamentos aprobados por la FDA.
"Realmente no ha habido una manera de determinar empíricamente, en lugar de teóricamente, qué fracción del proteoma humano puede ser blanco de moléculas pequeñas", dijo Cravatt.
El nuevo método se basa en parte en un enfoque conocido como descubrimiento de ligando basado en fragmentos, que utiliza moléculas de ligando candidatas de aproximadamente la mitad del tamaño de las moléculas pequeñas en medicamentos basados en píldoras. Para las pruebas iniciales para encontrar ligandos potenciales, tal "fragmento"las moléculas son mucho más eficientes que las moléculas del tamaño de un medicamento, y requieren bibliotecas de compuestos mucho más pequeñas para una búsqueda exhaustiva
El equipo de Cravatt unió moléculas de fragmentos candidatos a una clase de otras moléculas que, cuando pueden acercarse lo suficiente, reaccionan fuertemente con los aminoácidos de cisteína en las proteínas, bloqueando los ligandos a las proteínas con fuertes enlaces "covalentes".
"Todavía necesita una interacción basada en la afinidad, pero el evento de enlace covalente proporciona un impulso significativo en la potencia", dijo Keriann M. Backus, investigadora asociada en el laboratorio Cravatt, quien es el primer autor del estudio con TSRI Professional Scientific CollaboratorBruno Correia.
Los científicos idearon un sistema de detección en el que pueden aplicar estas moléculas de fragmentos de enlace covalente una por una a colecciones enteras de proteínas expresadas en células humanas. El método puede incluso usarse con células vivas intactas en un plato de cultivo. El sistemapermite a los investigadores detectar e identificar qué fragmentos de molécula pequeña se han unido covalentemente a qué proteínas en las muestras y qué sitios específicos en las proteínas son responsables de la unión.
Aplicando una pequeña biblioteca de fragmentos reactivos a la cisteína a las proteínas que se encuentran en dos tipos de células cancerosas humanas, los científicos descubrieron que los fragmentos "ligaron" con éxito más de 750 cisteínas diferentes encontradas en más de 600 proteínas distintas, lo que equivale amás del 20 por ciento de todas las proteínas analizadas en las muestras.
Muchas de estas proteínas pertenecían a clases de proteínas, como los factores de transcripción, que se han considerado prácticamente indignas y, por lo tanto, "no administrables". De hecho, alrededor del 85 por ciento de las proteínas recién ligadas no están incluidas en una base de datos estándar de proteínas conligandos de molécula pequeña conocidos.
"Este experimento ha expandido efectivamente lo que pensamos que es el proteoma ligandable", dijo Backus.
Potencial para desarrollar sondas y medicamentos
Los investigadores pudieron confirmar la precisión del sistema, por ejemplo, al demostrar que puede identificar los objetivos proteicos conocidos de un medicamento contra el cáncer de unión covalente, ibrutinib.
El equipo también demostró que algunas de las moléculas de ligando de unión a proteínas identificadas con el sistema tienen una fuerte actividad biológica y, por lo tanto, tienen el potencial de convertirse en sondas científicas o medicamentos. Ligandos recientemente descubiertos para las enzimas IDH1 e IDH2, paraejemplo, resultó bloquear la actividad de las versiones normales de las enzimas, así como las versiones mutantes implicadas en muchos tipos de cáncer.
En una serie final de experimentos, el equipo demostró que uno de sus ligandos identificados inhibe las actividades de caspasa-8 y caspasa-10, dos enzimas que ayudan a activar el proceso de autodestrucción celular conocido como apoptosis. Un exceso de apoptosisSe cree que contribuye a afecciones neurodegenerativas como el Alzheimer y la enfermedad de Huntington, así como al daño cerebral que ocurre después de los accidentes cerebrovasculares y otras lesiones cerebrales. Por el contrario, se cree que la falta de apoptosis en ciertas células contribuye a los cánceres y las enfermedades autoinmunesSin embargo, los científicos no entienden lo suficiente sobre el papel de estas enzimas, ya que no han podido encontrar moléculas pequeñas que inhiban selectivamente las caspasas específicas.
En este caso, el equipo de Cravatt descubrió que su ligando anti-caspasa inicialmente identificado funciona uniendo las formas precursoras de caspasa-8 y -10. Modificaron químicamente el ligando en uno que une selectivamente solo el precursor de caspasa-8, y, utilizando sus dos ligandos como sondas, pudieron descubrir nuevos detalles de cómo la caspasa-8 y -10 promueven la apoptosis en las células T humanas.
"En esencia, demostramos que nuestra nueva plataforma funciona y que podemos usar los ligandos que identifica para hacer una biología útil", dijo Backus.
Backus y otros miembros del laboratorio Cravatt ahora están haciendo varios estudios adicionales: optimizando muchos de los ligandos recientemente identificados en sondas para explorar las funciones de las proteínas; creando un catálogo más completo de proteínas que contienen cisteína que son susceptibles de ser ligadas; y ampliando el método paraapuntar a otros aminoácidos además de la cisteína.
"Estaremos ocupados durante algún tiempo haciendo un seguimiento de este desarrollo", dijo Cravatt.
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Materiales proporcionado por Instituto de Investigación Scripps . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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