El Centro de Edición del Genoma del IBS publicó dos estudios a la vez Biotecnología de la naturaleza , que muestra la superioridad de Cpf1 como una herramienta precisa de edición del genoma sin mutaciones no deseadas.
Como una nueva herramienta en la edición del genoma CRISPR, Cpf1 ha provocado una explosión de interés por sus atributos que difieren de Cas9: requiere un solo ARN que el ensamblaje de ARN CRISPR es más simple; sus patrones de escisión escalonados pueden facilitar la sustitución del ADN existente con el deseadosecuencias, y reconoce secuencias de ADN ricas en timidina, que han sido menos exploradas que las secuencias ricas en guanosina reconocidas por Cas9. En resumen, se espera que Cpf1 amplíe el alcance de los sitios objetivo de edición del genoma CRISPR con mayor eficiencia. A pesar del vasto potencial de Cpf1Como una poderosa herramienta de edición del genoma, se ha demostrado poco sobre cómo, específicamente, la nueva herramienta encuentra sus objetivos. En una serie de dos artículos publicados en línea el 6 de junio en Nature Biotechnology, investigadores del Centro del IBS para la Edición del Genoma en Corea del Surmostró Cpf1 como una herramienta programable altamente específica que es adecuada para la edición de precisión del genoma y la generación informada de ratones mutantes utilizando CRISPR-Cpf1.
Los investigadores utilizaron dos tipos de proteínas de la familia Cpf1 AsCpf1 y LbCpf ya que son las más eficientes entre su tipo y realizaron Digenome-seq: una prueba que idearon para identificar la intención en el objetivo y no intencional fuera del objetivositios donde los investigadores querían que Cpf1 hiciera un corte en todo el genoma. El ADN genómico libre de células aislado de células humanas se escindió con RNP Cpf1 recombinantes premontados y se sometió a una secuenciación del genoma completo. Alineamientos uniformes de lecturas de secuencia, correspondientes al objetivo ylos sitios de escisión in vitro fuera del objetivo se identificaron computacionalmente.
Los análisis de todo el genoma mostraron que Cpf1 era altamente específico, mostrando menos sitios de escisión fuera del objetivo 6 para LbCpf1 y 12 para AsCpf1, en comparación con Cas9, escindiendo en> 90 sitios en el genoma humano Fig. 1a.Específicamente, en la mayoría de los sitios de escisión in vitro, los indeles que representan efectos fuera del objetivo estaban por debajo del 0.1%, mucho más bajos que aquellos en los sitios correspondientes en el objetivo, lo que sugiere que las dos proteínas Cpf1 prácticamente no tuvieron efectos fuera del objetivo ".Notablemente, tanto LbCpf1 como AsCpf1 dirigidos a un determinado sitio escindieron solo el sitio objetivo en todo el genoma humano ", dijo KIM Daesik, uno de los primeros autores del estudio Fig. 1b.
"Para reducir los efectos fuera del objetivo, introdujimos RNP Cpf1 premontados en las células, suponiendo que los RNP Cpf1, similares a los RNP Cas9, cortarían los sitios objetivo inmediatamente después de la transfección y serían degradados rápidamente por enzimas endógenas que rompen las proteínas, reduciendo asíefectos fuera del objetivo sin sacrificar los efectos sobre el objetivo ", dijo KIM Jin-Soo, el autor correspondiente de los dos documentos y Director del Centro del SII. De hecho, los Cpf1 RNP no indujeron ningún indels lo suficientemente alto como para producir mutaciones fuera del objetivositios Fig. 2.
Demostrando la notable especificidad de Cpf1, otro equipo de investigación del mismo Centro del SII logró introducir mutaciones mediadas por Cpf1 RNP en embriones de ratón: los investigadores apuntaron a Foxn1 un factor de transcripción que regula el sistema inmunitario, incluido el crecimiento de pelos de la piel, comoasí como la tirosinasa una enzima que cataliza la producción de melanina, un pigmento natural que determina el color de la piel. HUR K Junho, primer autor del estudio, dijo: "Los datos mostraron que el suministro de Cpf1 RNP a embriones de ratón resultó en la nocividadlas funciones genéticas previstas con altas frecuencias de mutación, 64% y 33% respectivamente. Trasplantamos los embriones de ratones mutantes en madres sustitutas y obtuvimos ratones con mutaciones específicas. Las mutaciones resultaron en ratones sin pelo y de pelo blanco respectivamente Fig. 3a ".Hur agregó: "Para investigar si Cpf1 tuvo efectos fuera del objetivo, realizamos una secuenciación del genoma completo utilizando ADN genómico aislado de un ratón mutante Foxn1 y su tipo salvaje hermano.El análisis de secuencia mostró que no se produjo una mutación fuera del objetivo.La secuenciación profunda dirigida de otros mutantes tampoco mostró mutación fuera del objetivo "
En el estudio, los investigadores utilizaron pulso eléctrico para impregnar RNP Cpf1 en hasta 50 embriones de ratón simultáneamente Fig. 3b. Esta nueva electroporación suministró el genoma de edición del genoma para generar animales mutantes. En comparación con la microinyección convencional, el método de electroporaciónfue fácil de llevar a cabo, rápido y escalable.
Al agregar Cpf1 a su caja de herramientas, la tecnología de edición CRISPR puede construir modelos de mouse más diversos. KIM Jin-soo, Director del Centro de Edición del Genoma del IBS y autor correspondiente de los dos estudios comentó: "Dado que los dos estudios han demostrado la especificidad superiorde Cpf1, esta nueva nucleasa se utilizará más ampliamente para la edición precisa del genoma que no produce mutaciones no deseadas. Las aplicaciones CRISPR Cpf1 no serán limitadas, sino que permanecerán abiertas, comenzando desde tratamientos terapéuticos como fármacos contra el cáncer no tóxicos, tratamientos con células madre hastavalor agregado de ganado y productos agrícolas "
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Materiales proporcionado por Instituto de Ciencias Básicas . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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