Investigadores de la Universidad de Tokio han descubierto más detalles sobre los pequeños defensores que aseguran la fertilidad mediante la protección de los genomas de células especializadas llamadas células germinales, que producen óvulos y espermatozoides. El complejo sistema se estudió utilizando una elección innovadora de material de investigación e interdisciplinariocolaboración.
Los pequeños defensores del genoma están hechos de hebras cortas de ARN, el primo molecular del ADN, llamado piRNA.
"Estamos interesados en cómo se hacen los piRNA porque estas moléculas son parte de una vía fundamental que los animales, desde los insectos hasta los humanos, usan para defender sus genomas de células germinales. Sabemos que el piRNA es esencial para la fertilidad y también está implicado en algunos cánceres,"dijo el profesor Yukihide Tomari, líder del equipo de investigación en el Instituto de Biociencias Cuantitativas de la Universidad de Tokio.
Aunque los investigadores reconocen su importancia fundamental, múltiples desafíos han hecho que estudiar piRNA sea lento y difícil.
El equipo de UTokyo ha revelado que una proteína llamada Zucchini procesa el ARNip de una forma larga inmadura a una forma intermedia más corta. Ese ARNip intermedio es luego madurado a una forma funcional por otra proteína llamada Trimmer. Además, la secuencia de ARN que Zucchini reconoce comosu señal para cortar piRNA inmaduro largo es más complejo de lo que se pensaba anteriormente.
Camino a piRNA
Los investigadores comenzaron modificando genéticamente las células de ovario del gusano de seda para que no pudieran completar el paso final de maduración de piRNA por Trimmer, dejando a las células con mucho pre-piRNA intermedio para estudiar.
"Obtener las células completamente modificadas fue un gran desafío técnico, no saber cuál era un efecto genuino de cambiar la vía del piRNA y qué podría ser un efecto secundario accidental de la modificación genética", dijo el investigador asociado Natsuko Izumi, bioquímico y co.-primer autor de la publicación reciente.
Informes anteriores de otros grupos desdibujaron el papel de la proteína Zucchini, una controversia que Tomari atribuye a la dificultad intrínseca de estudiar la vía de producción de piRNA fuera del contexto celular completo. De hecho, tanto Zucchini como Trimmer se sientan en la superficie del "fábricas de energía "de las células, las mitocondrias, pero las proteínas pierden sus características originales una vez que se purifican.
El método innovador del equipo de UTokyo para estudiar los "gránulos de células crudas" donde las proteínas pueden funcionar en una situación más natural en la superficie mitocondrial reveló que, de hecho, Zucchini corta el ARNip inmaduro largo y lo convierte en pre-ARNip intermedio.
Además, los investigadores descubrieron cómo Zucchini reconoce dónde cortar las cadenas de ARN.
"La secuenciación de próxima generación puede producir una gran cantidad de datos, pero como una mezcla de señales significativas y ruido aleatorio. La tarea más difícil fue limpiar el conjunto de datos y organizarlo en una hipótesis que sea experimentalmente comprobable", explicóInvestigador asociado Keisuke Shoji, especialista en bioinformática y coautor del artículo de investigación.
Después del análisis, Shoji identificó un motivo novedoso en las secuencias de ARN en el que Zucchini prefiere cortar una cadena de ARN inmadura. Experimentos adicionales usando pellets de células crudas por Izumi confirmaron que alterar el motivo impide la producción normal de pre-piRNA por Zucchini.
"Nos sorprendió saber que la firma de secuencia simple que se creía que era el sello distintivo del reconocimiento de Zucchini en realidad no es esencial, pero Zucchini prefiere un motivo mucho más complejo. Imaginamos que la ruta de piRNA es tan complicada porqueEl piRNA es esencial para defender el genoma contra diversas secuencias invasoras y proteger la fertilidad: las células necesitan un sistema de defensa flexible y robusto ", dijo Tomari.
Innovaciones para estudiar piRNA
Históricamente, los investigadores han luchado por recolectar suficiente material para estudiar la vía del piRNA porque generalmente solo está activa en las células germinales.
"Lo hemos hecho en el pasado, pero disecar los ovarios de los insectos es una tarea difícil", explicó Tomari.
La primera innovación se produjo en 2009 cuando el entonces estudiante graduado Shinpei Kawaoka y el profesor asociado Susumu Katsuma del Departamento de Biología Agrícola y Ambiental de UTokyo detectaron la producción continua de piRNA en células tomadas del ovario de un gusano de seda y cultivadas en una placa de laboratorio.
Sin embargo, los nuevos descubrimientos sobre el ARNip todavía se basaron solo en el análisis genético, no en la observación directa de las moléculas involucradas en la producción del ARNip. La técnica normal de romper las células y analizar la porción líquida ligera "limpia" reveló solo que la vía del ARNip esno activo allí
En 2011, el equipo de investigación de Tomari junto con Kawaoka, quien ahora dirige su propio grupo de investigación en la Universidad de Kyoto, y Katsuma hicieron su segunda innovación.
"Fue fortuito", recuerda Tomari.
Dado que nada más funcionaba, Kawaoka trató de analizar la porción de células que normalmente se desecha en bioquímica, lo que Tomari llama el "gránulo sucio y crudo" hecho de todos los sólidos que quedan después de que las células se rompen.
"Para los biólogos modernos esto puede parecer una idea loca, pero este enfoque es la clave de nuestros estudios", dijo Tomari.
Luego, en 2016, Izumi separó cuidadosamente diferentes componentes en el sedimento de células crudas y descubrió que las actividades de procesamiento de piRNA residen en la superficie mitocondrial, lo que los llevó a descubrir la identidad largamente buscada de la enzima Trimmer.
Desde el desarrollo de estas innovaciones, el equipo de investigación ha trabajado para definir la ruta de producción de piRNA en detalle y planea continuar caracterizando las etapas anteriores y posteriores de la ruta de piRNA.
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Materiales proporcionado por Universidad de Tokio . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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