Un equipo de investigación del Hospital General de Massachusetts MGH informa que varios de los editores de bases CRISPR desarrollados recientemente, que crean cambios específicos en una sola base de ADN, pueden inducir efectos generalizados fuera del objetivo en el ARN, que se extienden más allá del ADN específico.recibir publicación anticipada en línea en Naturaleza también describe editores de base de variantes de ingeniería que reducen significativamente la incidencia de ediciones de ARN al tiempo que aumentan la precisión de la edición de ADN en el objetivo.
"La mayor parte de la investigación de la edición de bases fuera del objetivo se ha centrado en el ADN, pero hemos descubierto que esta tecnología también puede inducir grandes cantidades de alteraciones del ARN", dice J. Keith Joung, MD, PhD, del Departamento de Patología de MGHy autor principal de la Naturaleza informe. "Este sorprendente hallazgo sugiere la necesidad de observar más que solo alteraciones genéticas cuando se consideran los efectos no deseados fuera del objetivo de los editores de bases en las células. También mostramos la viabilidad de reducir estos efectos creando variantes que reduzcan selectivamente el objetivoEdición de ARN mientras se preserva la actividad de ADN en el objetivo ".
A diferencia de las nucleasas de edición de genes CRISPR-Cas, que inducen roturas de ADN de doble cadena dirigidas para realizar cambios genéticos, los editores de bases CRISPR pueden cambiar un solo nucleótido en una cadena de ADN sin inducir tales roturas. Mientras CRISPR-Las nucleasas cas se pueden comparar con las tijeras, explica Joung, los editores de bases se pueden comparar con un lápiz. Las proteínas de fusión que usan una forma modificada de CRISPR-Cas como guía para el sitio objetivo, los editores de bases usan una enzima llamada desaminasa para modificar un específiconucleótido, creando así cambios que pueden conducir a alteraciones específicas del ADN, por ejemplo, cambiar la citosina en timina.
Aunque la mayoría de los investigadores se han centrado en las actividades de edición de ADN de los editores de bases, la desaminasa en el editor de citosina a timina más comúnmente utilizado se identificó originalmente por su capacidad para modificar el ARN. Esto llevó al equipo de MGH a investigar si podríainducen efectos de ARN fuera del objetivo. Sus experimentos en líneas celulares de hígado y riñón embrionario mostraron que, si bien el editor de base comúnmente utilizado que probaron indujo ediciones eficientes en el sitio de ADN objetivo, también condujo a decenas de miles de citosina a uraciloedita en todo el transcriptoma, el rango completo de ARN transcrito en una célula. Encontraron resultados similares cuando probaron uno de los editores de bases más nuevos dirigidos a adenina.
Para investigar la posibilidad de reducir o eliminar las ediciones de ARN no deseadas, el equipo de MGH examinó a 16 editores con versiones de ingeniería de las enzimas desaminasas, identificando dos que fueron tan eficientes como la versión original para inducir efectos de ADN en el objetivo e inducir notablemente menos ARNde hecho, estas variantes SECURE SElective Curbing of Unwanted RNA Editing fueron incluso más precisas que la desaminasa inalterada para inducir las ediciones de ADN deseadas.
"Nos sorprendió bastante la cantidad, decenas de miles, de ediciones de ARN y la frecuencia de estas alteraciones que observamos con las dos clases de editores de bases", dice el autor principal Julian Grünewald, MD, MGH Molecular Pathology yHarvard Medical School. "También nos alegramos de ver que podíamos reducir sustancialmente esas ediciones de ARN no deseadas con nuestras variantes de editor de base SEGURO".
Joung señala que investigar cualquier impacto potencial de estos efectos de ARN en las aplicaciones experimentales y clínicas de la edición de bases CRISPR es un importante paso siguiente que su equipo está dando. "Mostramos que el editor de bases de citosina ampliamente utilizado que estudiamos tiene un efecto modesto en las célulasla viabilidad cuando se expresa en una línea celular humana, mientras que las variantes SECURE no lo hacen. Para aplicaciones de investigación, los científicos que usen editores de base deberán tener en cuenta los posibles efectos de ARN fuera del objetivo en sus experimentos. Para aplicaciones terapéuticas, nuestros resultados argumentan aún más para limitar laduración de la expresión del editor base en el menor tiempo posible y la importancia de minimizar y tener en cuenta los posibles impactos de estos efectos en las evaluaciones de seguridad ".
Joung, profesor de Patología en la Facultad de Medicina de Harvard, agrega: "Otra área importante del trabajo en curso es extender nuestros esfuerzos para minimizar estas ediciones de ARN no deseadas no deseadas. Actualmente estamos tratando de diseñar editores de bases de adenina SEGUROS y explorar losdirigirse a los efectos de ARN de los editores de bases de citosina que usan otras enzimas desaminasas diferentes a las del editor que investigamos. Nuestro objetivo es generar un conjunto de editores de bases con actividades de edición de ARN minimizadas que puedan usarse tanto para aplicaciones de investigación como terapéuticas ".
Los plásmidos que codifican editores de bases de variantes seguras estarán disponibles en el repositorio de plásmidos Addgene en http://www.addgene.org/crispr-cas .
coautores adicionales de la Naturaleza los trabajos son Ronghao Zhou, Sara García, PhD, Sowmya Iyer, PhD, Caleb Lareau y Martin Aryee, PhD, todos de MGH Molecular Pathology. El estudio fue respaldado por el contrato HR0011-17-2-0042 de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa HR0011-17-2-0042;Los Institutos Nacionales de Salud otorgan RM1 HG009490 y R35 GM118158, y el Premio Académico de Investigación Desmond and Ann Heathwood MGH.
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Materiales proporcionado por Hospital General de Massachusetts . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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