Un equipo de investigadores de la Universidad de Nagoya, RIKEN y la Universidad de Ehime ha logrado desarrollar un agente de etiquetado fluorescente fotoestable que permite la bioimagen a largo plazo de células vivas en la región del infrarrojo cercano. Esta nueva sonda fluorescente ha demostrado su uso para moléculas individuales a largo plazo, imágenes profundas multicolores y 3D. Se descubrió que el nuevo agente de etiquetado del equipo es prácticamente útil para la obtención de imágenes in vivo de vasos sanguíneos en cerebros de ratones, y se espera que tenga más aplicaciones en ciencias de la vida e investigación médica.
Nagoya, Japón - Un grupo de químicos en el Instituto de Biomoléculas Transformativas ITbM, Universidad de Nagoya, ha desarrollado un nuevo tinte fluorescente fotoestable emisor de infrarrojo cercano NIR PREX 710 tinte de xanteno fotorresistente que puede serentusiasmado con 710 nanómetros para tener usos que van desde imágenes de moléculas individuales a largo plazo hasta imágenes profundas in vivo, según un estudio publicado en la revista Edición internacional Angewandte Chemie .
PREX 710 tiene una estructura molecular que consiste en un resto de óxido de fosfina P = O en lugar de oxígeno en su núcleo de xanteno tricíclico fusionado, y 2 grupos metoxi OMe en el anillo aromático periférico, que permite que el colorante se absorbay emiten en la región NIR, y explican su alta capacidad química y fotoestabilidad, respectivamente. Además, el éster PREX 710 NHS puede unirse químicamente a biomoléculas, incluidas proteínas, azúcares y pequeños ligandos orgánicos, lo que puede conducir a observaciones de diversas estructurasy eventos en células vivas.
Junto con los investigadores de RIKEN y la Universidad Ehime, el equipo descubrió que PREX 710 podría usarse para imágenes fluorescentes de una sola molécula en condiciones fisiológicas. La alta fotoestabilidad de PREX 710 permite imágenes repetidas y sus propiedades específicas de absorción / emisión de luz enla región NIR permite la obtención de imágenes multicolores con su uso con otros colorantes fluorescentes.Además, al unir el éster PREX 710 NHS con un polisacárido dextrano, el equipo logró obtener imágenes 3D in vivo de vasos sanguíneos en cerebros de ratones.posible por la alta estabilidad química de PREX 710 dentro del torrente sanguíneo, así como por el uso de radiación NIR para mirar profundamente dentro de los tejidos.La alta fotoestabilidad, solubilidad en agua y estabilidad química, junto con su baja citotoxicidad y el uso de NIRla radiación convierte a PREX 710 en una herramienta poderosa para visualizar procesos y estructuras moleculares durante largos períodos sin fotoenclavamiento dentro de los organismos vivos.
La imagen de fluorescencia es una técnica en la que una proteína específica u orgánulo celular se marca con una sonda fluorescente y se utiliza para visualizar procesos y estructuras de organismos bajo un microscopio fluorescente. Aunque muchos agentes de marcado fluorescente, como proteínas fluorescentes y pequeñas moléculas orgánicas fluorescentesSe han desarrollado hasta ahora, la mayoría de ellos usan radiación en la región visible. Las desventajas de usar luz visible como las luces azules o verdes surgen de su alta energía, que puede causar daños a las muestras vivas cuando están expuestas por largos períodos.Además, cuando las muestras se excitan con luz visible, la autofluorescencia de las propias muestras tiende a interferir con las señales de las sondas fluorescentes. También se sabe que las biomoléculas como la hemoglobina tienden a absorber la luz visible, por lo que la luz no alcanza profundidaddentro de los organismos, lo que ha hecho es difícil visualizar los vasos sanguíneos y órganos vivos.
Estos problemas que surgen de las imágenes con luz visible podrían superarse utilizando radiación NIR, que tiene una longitud de onda más larga, por lo tanto, una energía más baja en comparación con la luz visible. Sin embargo, muchos de los tintes NIR desarrollados hasta ahora se basan en tintes de cianina, que consistende cadenas de polimetina grupos metino CH conectados por enlaces alternos simples y dobles que tienen heterociclos que contienen nitrógeno unidos a cada extremo de la cadena. La mayoría de los tintes de cianina sufren de baja química y fotoestabilidad, lo que dificulta la bioimagen a largo plazocon estos colorantes debido al foto-blanqueo a lo largo del tiempo. Aunque se pueden agregar agentes anti-decoloración para prevenir el foto-blanqueo, pueden no ser aplicables en experimentos con células vivas.
"El grupo Yamaguchi ha estado interesado en hacer tintes fotoestables para bioimagen que absorben y emiten en diferentes longitudes de onda", dice el Dr. Masayasu Taki, profesor asociado en el grupo del profesor Shigehiro Yamaguchi en ITbM, y uno de los líderes de este estudio."Se sabe que las longitudes de onda de excitación y emisión de los tintes aumentan con un aumento de los enlaces dobles conjugados en su estructura, pero más anillos complican la síntesis y también conducen a una baja solubilidad en agua, lo que no es ideal para la obtención de imágenes en condiciones fisiológicas. Nosotrospor lo tanto, decidió sintetizar diferentes tintes cambiando los elementos en el núcleo del anillo de xanteno de oxígeno a fósforo "
"El Dr. Marek Grzybowski, un investigador postdoctoral en nuestro grupo, ha estado trabajando en este proyecto y ha ideado las síntesis de muchos de los colorantes fluorescentes a base de rodamina desarrollados recientemente en nuestro grupo", describe Taki.
Durante sus estudios, el grupo también descubrió que uno de los derivados de PREX 710 era susceptible al ataque hacia una forma reducida de glutatión GSH, que es un tripéptido que actúa como antioxidante en las células. Aunque la decoloración de los colorantes por GSHgeneralmente se considera un inconveniente en la imagen fluorescente en vivo, el grupo pensó que este tinte podría servir como una sonda NIR prometedora para monitorear el nivel de GSH en células y tejidos vivos.
"Después de sintetizar y probar varios derivados de xanteno, encontramos PREX 710, que exhibía una excepcional fotoestabilidad química y, por lo tanto, demostró ser un fluoróforo emisor de NIR práctico, que es permeable a la membrana y se localiza principalmente en las mitocondrias de HeLa viva.células ", explica Taki." Estamos realmente emocionados de ver que al usar PREX 710, pudimos visualizar componentes de células vivas durante muchos minutos en comparación con solo unos pocos segundos que se podrían lograr con los tintes convencionales ".
En colaboración con el Dr. Yasushi Okada, líder del equipo del Centro RIKEN para la Investigación de la Dinámica de los Biosistemas, el equipo descubrió que PREX 710 es aplicable para la imagen fluorescente de molécula única, una técnica que se sabe que requiere una fuerte radiación de luz. Sus estudios muestran queque bajo las mismas condiciones experimentales, el 80% de las señales fluorescentes de una sola molécula de PREX 710 podrían detectarse durante 2 minutos, mientras que la mitad de las señales desaparecieron en 20 segundos con Alexa Fluor 647 tinte de cianina. Los experimentos demuestran que PREX 710 puedevisualice claramente cada molécula individual por períodos prolongados sin ningún foto-blanqueo en ausencia de agentes anti-desvanecimiento.
Además, el equipo pudo utilizar PREX 710 en las imágenes multicolores de células HeLa vivas. Dado que las propiedades de excitación y emisión NIR de PREX 710 difieren de los colorantes fluorescentes de luz visible, se puede evitar la diafonía espectral para visualizarcada uno de los componentes celulares se tiñó con diferentes colorantes. Por ejemplo, fue posible obtener imágenes multicolores de células HeLa vivas al teñir la membrana celular, el núcleo y las mitocondrias con colorantes fluorescentes disponibles comercialmente, como DiI y SiR-DNA, junto con PREX 710, respectivamente.
La utilidad práctica de PREX 710 también se demostró mediante la aplicación de la sonda para imágenes profundas in vivo, que se llevó a cabo en colaboración con los doctores Takeshi Imamura y Ryosuke Kawakami de la Universidad de Ehime. Usando el sitio de bioconjugación de PREX 710, dextrano,un polisacárido compuesto de moléculas de glucosa, fue marcado fluorescentemente e inyectado en el torrente sanguíneo a través de la vena de la cola del ratón. La imagen 3D de los vasos sanguíneos en el cerebro del ratón podría construirse debido al alto brillo de PREX 710 en la región NIR que permite el registro deseñales de fluorescencia en tejido profundo.
"Nos complace demostrar que PREX 710 y sus derivados son herramientas útiles para la investigación de la dinámica de organismos vivos, tejidos, células y moléculas", dice Taki. "Actualmente estamos trabajando en el desarrollo de otras sondas de fluorescencia NIR quepodría usarse para teñir proteínas específicas, así como para examinar estructuras y procesos vivos con mayor profundidad. Esperamos que esto conduzca a la visualización y aclaración de varios fenómenos en los sistemas vivos, incluidos los síntomas médicos ", continúa.
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Materiales proporcionado por Instituto de Bio-Moléculas Transformativas ITbM, Universidad de Nagoya . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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