Los químicos de ITbM, Universidad de Nagoya han desarrollado un tinte fluorescente súper fotoestable, PhoxBright 430 PB430, para visualizar la ultraestructura celular mediante microscopía de súper resolución. La excepcional fotoestabilidad de este nuevo tinte permite la formación continua de imágenes STED y su capacidad de fluorescenciaetiquetar proteínas, PB430 demuestra su uso en la construcción 3D y en imágenes multicolores de estructuras biológicas.
Nagoya, Japón - La microscopía de fluorescencia de súper resolución, que ha sido reconocida por el Premio Nobel de Química 2014, nos permite visualizar sistemas biológicos y obtener una comprensión detallada de la dinámica compleja de las biomoléculas. En particular, el agotamiento de las emisiones estimuladas STED la microscopía se utiliza ampliamente para examinar varios procesos en sistemas vivos, debido a su rápida velocidad de adquisición y compatibilidad para varias muestras biológicas.
Los químicos del Instituto de Bio-Moléculas Transformativas ITbM de la Universidad de Nagoya han desarrollado un nuevo tinte fluorescente fotoestable, PhoxBright 430 PB430, que permite obtener imágenes STED de súper resolución continua de células marcadas con fluorescencia. Como PB430 contiene un resto funcional paraPermitir la conjugación con un anticuerpo, los objetivos específicos de la biomolécula dentro de una célula pueden teñirse por inmunofluorescencia. La excepcional fotoestabilidad de PB430 ha demostrado ser útil para construir una imagen 3D-STED de microtúbulos estructuras de proteínas en forma de tubo que forman el citoesqueleto, que esel marco interno de una célula y logre imágenes STED multicolores de citoesqueletos inmuno marcados con fluorescencia mediante la combinación de PB430 fotoestable y colorantes disponibles comercialmente.
Las propiedades únicas de PB430 lo convierten en una herramienta poderosa para revelar las estructuras y funciones de las células, y tiene el potencial de aplicarse para una visualización prolongada del movimiento de orgánulos y moléculas dentro de las células. Los resultados de este estudio se informaron recientemente enel Revista de la Sociedad Americana de Química .
Para lograr una alta resolución en microscopía STED, una muestra biológica marcada con un fluoróforo un tinte fluorescente utilizado para marcar muestras biológicas como proteínas, tejidos y células se irradia con un haz de excitación fluorescente junto con un STED en forma de rosquillahaz para suprimir la excitación de las moléculas circundantes.A pesar de ser una técnica poderosa, la necesidad de un haz STED de alta intensidad, que conduzca al foto-blanqueo de tintes, ha sido un problema importante para el uso práctico de la microscopía STED en la imagen continua de células vivas.
Los investigadores han informado previamente sobre un colorante fluorescente, "C-Naphox", que ha exhibido una fuerte fotoestabilidad en las imágenes STED. El grupo ahora ha optimizado la estructura de C-Naphox y ha desarrollado un nuevo colorante fluorescente fotoestable PB430, que puede usarse parala visualización de estructuras dentro de las células.
"C-Naphox ha demostrado ser un tinte extremadamente fotoestable para la obtención de imágenes STED de varios materiales, por lo que decidimos ajustar aún más sus propiedades para poder aplicarlo para visualizar las ultraestructuras", dice Masayasu Taki, profesor asociado de ITbM yuno de los líderes de esta investigación. "Nuestro nuevo colorante, PB430 muestra una mayor solubilidad en agua, fluoresce eficientemente en medios acuosos y es capaz de etiquetar anticuerpos. Nos complace observar que también exhibe alta fotoestabilidad en condiciones STED", describeTaki.
Chenguang Wang, investigador postdoctoral en el grupo de investigación del profesor Shigehiro Yamaguchi en ITbM, sintetizó PB430 y realizó los experimentos de imagen STED. De manera similar a C-Naphox, el nuevo tinte fluorescente es estable al aire y consiste en un anillo estructuralmente reforzadoesqueleto conjugado con \ beta - fusionado que contiene una unidad de óxido P fosforado, que es el origen del nombre PhoxBright. En lugar del resto trifenilamina, PB430 tiene un grupo de ácido carboxílico que puede conjugarse con anticuerpos para inmunomarcaje a través de la formación de un N-hidroxilsuccinimidiloNHS éster
Los experimentos de formación de imágenes STED de anticuerpos conjugados con PB430 en células HeLa fijas condujeron a imágenes de fluorescencia de microtúbulos inmunomarcados, con solo un ligero blanqueo fotográfico. PB430 actuó como un marcador fluorescente para proteínas y su intensidad de fluorescencia se mantuvo incluso cuando se conjugó.
"La alta fotoestabilidad de PB430 permite obtener imágenes de fluorescencia que no era posible fácilmente con los tintes convencionales", explica Taki. "Por ejemplo, PB430 se puede usar en imágenes 3D-STED del citoesqueleto, porque puede soportar el haz continuo de STED enel eje z después de la imagen en el eje xy "
Además, el grupo demostró que PB430 podría aplicarse a imágenes STED multicolores aprovechando la diferencia en la fotoestabilidad entre varios tintes fluorescentes. Realizaron experimentos de imagen STED de microtúbulos y vimentina proteínas de filamentos intermedios del citoesqueleto, inmunomarcados con PB430y Alexa Fluor 430 un tinte fluorescente, respectivamente. Cuando Alexa Fluor 430 se decolora después de tomar la primera imagen STED, la segunda imagen solo muestra microtúbulos marcados con PB430. Restar la primera imagen de la segunda imagen revela la vimentina etiquetada con Alexa Fluor 430filamentos
"Por lo general, las imágenes STED multicolores requieren varios láseres de excitación y un solo rayo láser STED, pero en la combinación de Alexa Fluor 430 con PB430, solo necesitamos un solo par de láseres de excitación y STED", explica Taki. "Al usar PB430, creemos que será posible realizar imágenes STED multicolores con varias combinaciones diferentes de varios tintes fluorescentes. El siguiente paso es mejorar la permeabilidad de la membrana celular del tinte para visualizar las funciones de muchas otras estructuras celulares ".él continúa.
"Nuestra investigación ha demostrado que la fuerte fotoestabilidad y compatibilidad fisiológica de PB430 permite imágenes repetidas, así como imágenes 3D e imágenes multicolores de células por microscopía STED", dice Yamaguchi. "Esperamos poder aplicar nuestro tinte fluorescente para una vida prolongadaimagen celular por microscopía STED y microscopía de molécula única, para examinar varios procesos biológicos "
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Materiales proporcionado por Instituto de Bio-Moléculas Transformativas ITbM, Universidad de Nagoya . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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