Casi todas las células del cuerpo humano, desde latir las células del corazón hasta las células inmunes que engullen las bacterias, funcionan con energía química producida por orgánulos especializados llamados mitocondrias. El proceso de generación de energía crea productos de desecho que pueden ser altamente tóxicos, por ejemplo,plantas de energía reales, estos orgánulos requieren un estricto control de calidad y supervisión.
Esta tarea de vida o muerte asegura la supervivencia de la célula y el organismo al que pertenece. Las disfunciones en la capacidad de una célula para eliminar las mitocondrias dañadas se han relacionado con afecciones que van desde el cáncer hasta la enfermedad neurodegenerativa, en particular el Parkinson, en el queLas neuronas hambrientas de energía son muy vulnerables a los efectos tóxicos de las mitocondrias defectuosas.
En la edición del 19 de abril de célula molecular , los científicos de la Facultad de Medicina de Harvard informan haber desarrollado una nueva técnica para analizar, con una precisión cuantitativa sin precedentes, cómo las células inician la eliminación de las mitocondrias defectuosas por el sistema de autofagia o "autoalimentación" de la célula. La metodología les permitió estudiar,Por primera vez, este proceso en las neuronas humanas derivadas de las células madre.
Al tomar "instantáneas digitales" del paisaje de proteínas a medida que las células marcan las mitocondrias dañadas para la autofagia, el equipo de investigación generó la imagen más clara hasta la fecha de la dinámica de este proceso, incluidas mediciones absolutas de las reacciones de modificación de proteínas y su abundancia y cambios a lo largo del tiempo.
Los resultados preparan el escenario para estudios detallados de las conexiones entre el daño mitocondrial, la muerte celular y la enfermedad, y establecen un enfoque tecnológico que puede usarse para descubrir los mecanismos de las vías celulares defectuosas en muchos otros contextos, dijeron los autores.
"Si alguna vez va a haber un medicamento que apunte a esta vía con el objetivo de tratar el Parkinson u otras enfermedades neurodegenerativas, vamos a necesitar este nivel de detalle para comprender cómo funcionan los candidatos a medicamentos", dijo el autor principal del estudio J.Wade Harper, el HMS Bert y Natalie Vallee Profesor de Patología Molecular y Presidente del Departamento de Biología Celular.
El sistema de alarma molecular para el control de calidad mitocondrial involucra dos enzimas: la proteína quinasa PINK1, que modifica químicamente las proteínas con fosfato, y la ubiquitina ligasa PARKIN, que marca las proteínas diana con una molécula llamada ubiquitina.
En condiciones normales, las mitocondrias sanas llevan poco PINK1 en su superficie externa. Sin embargo, cuando se dañan, las mitocondrias acumulan PINK1, que transfiere fosfato a PARKIN para activarlo.
Una vez activado, PARKIN transfiere ubiquitina a una variedad de proteínas diferentes, creando una "capa de ubiquitina" en la superficie mitocondrial. Cuando se alcanza un cierto umbral de ubiquitina, se desencadena el reclutamiento de la maquinaria celular "autocomida", lo que lleva aa la degradación de las mitocondrias.
Numerosos estudios han relacionado las mutaciones en PINK1 y PARKIN con la enfermedad de Parkinson, que implica la muerte de ciertas neuronas y la acumulación de proteínas mal plegadas en el cerebro. Los investigadores han hecho grandes avances en la descripción de la vía PINK1-PARKIN, peromuchas de sus características críticas han quedado mal entendidas.
Confección del abrigo
Se sabe que Ubiquitin marca sus proteínas diana en residuos específicos del aminoácido lisina. Sin embargo, esto ocurre solo para un pequeño subconjunto de residuos de lisina, y determina con precisión qué lisinas se modifican y por qué ha sido un desafío para el campo -especialmente para los más de una docena de objetivos PARKIN en la superficie mitocondrial. Además, la abundancia de estos objetivos no estaba clara, lo que podría afectar el proceso de ubiquitilación.
El trabajo previo del laboratorio Harper, en colaboración con Steve Gygi, profesor de biología celular del HMS, había establecido métodos que permiten la detección de residuos de lisina individuales en proteínas que están unidas a la ubiquitina.
El equipo de investigación amplió este enfoque en el estudio actual. Encabezado por el autor principal Alban Ordureau, investigador del HMS en biología celular, desarrollaron un nuevo método: monitoreo de reacción paralela al objetivo PARKIN Pt-PRM para evaluarpaisaje de ubiquitilación de proteínas involucradas en el control de calidad mitocondrial a un nivel de detalle sin precedentes.
También crearon una biblioteca de péptidos de referencia que les permitió medir la abundancia precisa de dianas PARKIN y eventos de ubiquitilación individuales en mitocondrias dañadas.
En esencia, la biblioteca de péptidos de referencia permitió a los investigadores "contar" los eventos de ubiquitilación de una manera específica del sitio en más de una docena de proteínas de la superficie mitocondrial simultáneamente en un espectrómetro de masas.
Cuando se combina con mediciones dependientes del tiempo después del daño mitocondrial, el método produce una "instantánea digital" de los eventos de ubiquitilación a través de la superficie mitocondrial, que revela no solo la especificidad de modificación del sitio, sino que también proporciona una imagen cuantitativa del paisaje mitocondrial.
Al incluir péptidos de referencia que detectan eventos de fosforilación dependientes de PINK1, el equipo también pudo integrar la fosforilación objetivo con la ubiquitilación.
"Este es uno de los análisis más detallados de la vía de ubiquitina que se haya hecho nunca. No hay otro estudio que use este nivel de sofisticación para analizar dicho proceso", dijo Harper.
instantánea digital
La nueva técnica permite mediciones precisas y absolutas de los eventos de ubiquitilación de proteínas, en marcado contraste con los métodos anteriores que no son cuantitativos y no proporcionan especificidad del sitio de ubiquitilación.
"Este enfoque ahora nos da el rango dinámico completo", dijo Harper. "Podemos medir más de tres órdenes de magnitud para comprender mejor la cinética, la estequiometría, la organización espacial, la integración con la fosforilación y muchas otras características", dijo Harper.
Habilitado por una precisión mejorada, el equipo realizó el primer análisis cuantitativo de eventos relacionados con la ubiquitilación nativa en neuronas derivadas de células madre humanas genéticamente modificadas, un sistema más relevante para el estudio de enfermedades humanas que los modelos anteriores.
Esto incluyó un análisis de las neuronas dopaminérgicas, cuya pérdida es una característica principal del Parkinson, realizado en colaboración con Lee Rubin, profesor de células madre y biología regenerativa en Harvard. Hasta ahora, la mayoría de las investigaciones en esta área se han llevado a cabo encélulas cancerosas humanas inmortalizadas HeLa diseñadas para expresar PARKIN a niveles anormalmente altos para que los científicos puedan medir su actividad.
Harper, Ordureau y sus colegas compararon los dos modelos celulares en sus análisis, identificando similitudes y diferencias en la especificidad y el momento de los eventos de modificación. También encontraron residuos de lisina específicos en proteínas que se ubiquilaron selectivamente en las neuronas pero no en las células HeLa, yviceversa. Las implicaciones biológicas de estas diferencias siguen siendo desconocidas y son objetivos para estudios posteriores, dijeron los autores.
Los análisis ayudaron a arrojar nueva luz sobre las cuestiones actualmente debatidas en el campo, como si las cadenas de ubiquitina etiquetan indiscriminadamente las proteínas en las mitocondrias o si se dirigen con precisión a las específicas.
La respuesta puede ser "depende". En general, la ubiquitilación parece escalar con la abundancia de proteínas, pero los investigadores también encontraron evidencia de selectividad, particularmente dentro de ciertos elementos estructurales dentro de las proteínas objetivo.
La robustez del sistema experimental también permitió a los autores examinar varios aspectos mecanicistas de la vía, incluida, por ejemplo, una determinación del papel de la fosforilación de PARKIN por PINK1 en neuronas derivadas de células madre.
"Queremos saber cómo funcionan estos mecanismos porque queremos poder dirigirlos al descubrimiento de fármacos o encontrar formas de evitar las mutaciones que causan enfermedades en los pacientes", dijo Ordureau. "Ahora podemos analizar este proceso crítico en neuronalceldas con extremo detalle, y hacerlo a escala en un experimento. Con métodos anteriores, tenía que ejecutar docenas de experimentos para lograr resultados similares o menos precisos ".
La eficacia de su nuevo método ahora permite estudios mejorados de la vía PINK1-PARKIN y de su papel en enfermedades como el Parkinson, como se demuestra en este trabajo para los activadores de molécula pequeña de PINK1. El enfoque también se puede adaptar para descubrir elLos autores dijeron que los mecanismos de las vías defectuosas en otros sistemas y enfermedades.
"La ubiquitilación es un mecanismo fundamental que utilizan las células para eliminar componentes dañados o innecesarios para mantener su propia salud e integridad", dijo Harper. "Es relevante no solo para las mitocondrias, sino también para la eliminación de bacterias, agregados de proteínas y otros orgánulos. EstoLa tecnología podría emplearse para arrojar luz sobre la bioquímica de muchos sistemas diferentes ".
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Escuela de Medicina de Harvard . Original escrito por Kevin Jiang. Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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