El descubrimiento de reglas que gobiernan una variación del método de edición de genes CRISPR / Cas9 hace posible el uso de células vivas para fabricar compuestos metabólicos valiosos como productos farmacéuticos y nutracéuticos. Los investigadores del Rensselaer Polytechnic Institute RPI han desarrollado nuevas herramientas para controlar elvías de señalización en las células para fabricar compuestos, disminuyendo la producción de compuestos no deseados y aumentando la producción de compuestos valiosos.
La investigación, publicada en Investigación de ácidos nucleicos , describe un aspecto del método de edición de genes CRISPR / Cas9, que hace uso de dCas9, una proteína deshabilitada. Específicamente, los investigadores describen cómo variar un fragmento de ARN para crear múltiples herramientas que usan dCas9, cada una con la capacidadpara bloquear la actividad en un solo sitio a lo largo de complejas vías de señalización de múltiples pasos, sin diafonía.
"CRISPR es una de las técnicas de edición de genes más poderosas disponibles, pero hasta ahora, solo la hemos visto utilizada en el cuidado de la salud. Esta es la primera aplicación real de ingeniería metabólica para hacer productos de alto valor utilizando este enfoque de edición de genes".Dijo Mattheos Koffas, quien dirigió la investigación: "Si miras 10 años hacia el futuro, las personas podrían estar controlando miles de genes en un organismo, produciendo productos bastante valiosos".
El sistema CRISPR / Cas9 se deriva de una bacteria de defensa natural empleada contra virus familiares. "Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente espaciadas" o CRISPR, es un ADN bacteriano que contiene segmentos de ADN viral de exposiciones previas. Cuando el ADN viral invade elcélulas, las bacterias usan CRISPR para producir un fragmento de "ARN guía" que coincidirá con, o complementará, el ADN viral. El ARN guía está acoplado con el complejo de proteínas Cas9, que puede cortar el ADN. Así equipado, el Cas9 es capaz dedescomprima, enganche y corte el ADN viral complementario, deshabilitándolo. CRISPR / Cas9 se ha utilizado en aplicaciones de salud, como deshabilitar genes específicos para producir animales transgénicos para investigación.
CRISPR / Cas9 también tiene un enorme potencial como medio para controlar las rutas de señalización, las complejas comunicaciones químicas por las cuales las células realizan la mayoría de las funciones y producen las sustancias necesarias. Las instrucciones para los numerosos pasos en cada ruta de señalización están contenidas en el ADN. Si el procesose puede controlar en cada paso, bloqueando o permitiendo la transcripción de ADN en el sitio de un interruptor genético llamado "promotor", la salida de la célula también se puede controlar, redirigiendo su energía para producir los compuestos deseados.este método, CRISPR / dCas9, bloquea la transcripción mediante el uso de una proteína Cas9 desactivada para adherirse al ADN objetivo y permanecer en su lugar, frustrando los intentos adicionales de transcribir las instrucciones en esa secuencia de ADN en particular.
"La célula es una fábrica, y podemos hacernos cargo de la producción y hacer las cosas que queramos", dijo Brady Cress, primer autor de la investigación, que se realizó en los laboratorios de Koffas y Robert Linhardt en el Centro de Biotecnología Rensselaery Estudios Interdisciplinarios CBIS. "Con CRISPR / dCas9, lo que podemos hacer es hacer que los compuestos críticos, aquellos necesarios para construir los grandes compuestos de alto valor, sean más frecuentes al cerrar las vías de la competencia". Aunque el método CRISPR tieneUna gran promesa en ingeniería metabólica, se necesita una mejor comprensión para alcanzar su máximo potencial. Un área de investigación implica el riesgo de "diafonía", una complicación que ocurre cuando el ARN objetivo destinado a un promotor se une por error a otro promotor de secuencia similar, causandopara activar o bloquear otras secciones de las vías muy complejas.
el ADN es una cadena compuesta por cuatro nucleótidos: citosina, guanina, adenina o timina, cada uno de los cuales complementa uno de los cuatro nucleótidos de ARN. Para que el sistema CRISPR / Cas9 se adhiera al ADN y realice su tarea,los nucleótidos en la secuencia de ARN guía deben complementar el ADN objetivo, pero no siempre es necesaria una coincidencia exacta: uno o más de los nucleótidos pueden ser incorrectos y el ARN guía y el ADN objetivo aún pueden adherirse, aunque de manera imperfecta. Las reglas que gobiernanel grado de incompatibilidad que soportará el sistema no ha sido claro. Por ejemplo, en una cadena de 20 nucleótidos, ¿el ARN guía se uniría al ADN objetivo si hubiera un nucleótido incompatible? ¿Qué tal dos o tres?
Un sistema que tolera muchos desajustes aumenta el riesgo de diafonía a lo largo de una ruta de señalización, ya que una guía de ARN se une a múltiples promotores. Sin embargo, si el sistema tolera menos desajustes, hay menos riesgo de diafonía e investigadores pueden variar solo unas pocas secuenciasen el promotor y la guía complementaria de ARN para crear fácilmente múltiples herramientas. Debido a que hay cuatro nucleótidos, cada desajuste crea la oportunidad para más de una herramienta.
Cress examinó un promotor de 20 nucleótidos, enfocándose en una serie de tres nucleótidos en una porción específica de la secuencia. Cambió sistemáticamente hasta tres pares de bases consecutivamente, de manera de alto rendimiento, para comprender cuántos desajustes se requieren para prevenirdiafonía. En la secuencia de tres nucleótidos, Cress descubrió que el sistema se unirá con un desajuste, pero no se unirá con dos o tres desajustes.
"Este es un descubrimiento importante porque le permite diseñar herramientas que controlan diferentes genes al mismo tiempo sin ninguna diafonía", dijo Linhardt. "Las vías son complejas y debemos ser capaces de alcanzar múltiples partes en cualquier vía para mantenerla célula viva y controla la salida. Así que ahora podemos crear un número significativo de herramientas, en docenas, que se basan en el mismo promotor y se pueden controlar de forma independiente ".
Como prueba de concepto, Cress incorporó promotores que siguieron la nueva regla en una ruta modelo que las células usan para crear compuestos que varían entre incoloro, morado y verde, dependiendo de las secciones de la ruta que activó. Creó células conactivación a lo largo de diferentes secciones del camino, y produjeron los compuestos de los colores que él había predicho.
"La generación rápida de promotores híbridos T7-lac regulados por CRISPR / dCas9, reprimidos ortogonalmente para el control modular y sintonizable de los flujos de la vía metabólica en Escherichia coli" aparece en la edición del 12 de abril de 2016 de Nucleic Acid Research. La investigación ejemplifica latrabajo realizado en The New Polytechnic, abordando desafíos globales complejos y difíciles, la necesidad de una colaboración interdisciplinaria y verdadera, y el uso de las últimas herramientas y tecnologías, muchas de las cuales se desarrollan en Rensselaer.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Instituto Politécnico Rensselaer RPI . Original escrito por Mary L. Martialay. Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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