Desde los primeros días de CRISPR-Cas9, los investigadores han sabido que esta tecnología de edición de genes es excelente para romper cosas. Con precisión, estas herramientas tipo tijera se pueden enviar a cualquier lugar del genoma para cortar y romper un genPero exactamente dónde y cómo CRISPR-Cas9 alterará el gen era una incógnita. Hasta ahora. Los investigadores del Hospital Brigham and Women's, en colaboración con colegas del Broad Institute y el MIT, descubrieron que la edición de Cas9 sin plantillas es predecible, yhan desarrollado un modelo de aprendizaje automático que puede predecir inserciones y eliminaciones con gran precisión. El equipo, dirigido por los coautores co-corresponsales Richard Sherwood, PhD, David Liu, PhD y David Gifford, PhD, ha demostrado que este enfoque puede usarsepara editar y reparar mutaciones relacionadas con tres enfermedades en líneas celulares humanas: síndrome de Hermansky-Pudlak, enfermedad de Menkes e hipercolesterolemia familiar, con un resultado de reparación predecible en más de la mitad de los casos.Estos avances tienen implicaciones tanto para la investigación como para las aplicaciones clínicas.Los hallazgos del equipo se publican esta semana en Naturaleza .
"Al igual que muchos proyectos, este salió de un resultado desconcertante: queríamos usar CRISPR-Cas9 para causar un conjunto aleatorio de mutaciones en un punto particular del genoma, pero descubrimos que las mutaciones que estábamos obteniendo estaban lejosde forma aleatoria ", dijo Sherwood, investigador principal de la División de Genética de Brigham." Resulta que la secuencia subyacente a la que está dirigiendo CRISPR-Cas9 le permite predecir, con un alto grado de precisión, qué mutaciones son másprobable de obtener "
Muchas enfermedades genéticas surgen de inserciones y deleciones que interrumpen la función de un gen, por lo que ser capaz de replicarlas o repararlas con precisión sería un gran golpe. La sabiduría convencional entre los investigadores de CRISPR-Cas9 ha sostenido que la herramienta genera aleatoriamente inserciones y deleciones enun gen a menos que los investigadores incluyan una llamada plantilla de reparación. Pero el equipo de Sherwood descubrió que incluso sin una plantilla, uno puede predecir qué inserciones y deleciones tienen más probabilidades de ocurrir. En ciertos sitios genómicos, predomina una mutación particular: el equipo utilizóel término "precisa-50" para indicar cuándo una mutación de este tipo comprendía más del 50 por ciento de todos los principales productos de edición.
Para llevar a cabo su proyecto, Sherwood y sus colegas, incluido Christopher Cassa, PhD, investigador principal de la División de Genética de Brigham, construyeron una biblioteca de 2,000 ARN guía Cas9 gRNA emparejados con sitios de ADN objetivo. Usaron esta biblioteca para entrenarinDelphi, un modelo de aprendizaje automático. Descubrieron que inDelphi podía predecir eliminaciones de diferentes longitudes e inserciones de pares de bases individuales con alta precisión r = 0,87 en cinco líneas celulares humanas y de ratón, y que pronosticaba que hasta el 11 por ciento de los gRNA eran"preciso-50"
Para confirmar estos hallazgos, el equipo usó ARNg seleccionados para corregir mutaciones en células recolectadas de pacientes con enfermedades genéticas que resultan de microduplicaciones, un cambio cromosómico en el que se duplica una pequeña cantidad de material genético. Síndrome de Hermansky-Pudlak, especialmente comúnen puertorriqueños, causa deficiencia de coagulación de la sangre y albinismo. La enfermedad de Menkes produce deficiencia de cobre. El equipo también generó células con microduplicaciones que se encuentran en pacientes que producen hipercolesterolemia familiar, una enfermedad en la que los niveles de colesterol LDL son anormalmente altos.el Cas9 apropiado y el ARN guía corrigieron la mutación con alta eficiencia.
Los autores señalan que este trabajo sigue siendo una prueba de concepto, aunque promete en modelos celulares en el laboratorio, requiere más pruebas y pasos adicionales para llevarlo a la clínica. Además, solo entre 5 y 11 por cientode los ARN guía Cas9 cumplieron con el estándar de "precisión 50". Sherwood y el equipo ahora trabajarán para optimizar la eficiencia de los ARN guía entendiendo por qué ciertas inserciones o eliminaciones son mucho más comunes que otras. Esperan que otros aprovechenherramientas que han desarrollado para establecer estándares regulatorios para la precisión en aplicaciones terapéuticas existentes y ampliar qué aplicaciones pueden ser posibles.
"Actualmente, la mayoría de las empresas que están pensando en aplicaciones terapéuticas para CRISPR-Cas9 están pensando qué genes necesita romper para tratar una enfermedad. Nuestros hallazgos indican que es posible predecir dónde podremos reparar las mutaciones".dijo Sherwood. "No queremos conformarnos con una corrección de la mutación del 50 por ciento, queremos seguir mejorando. Ahora que sabemos que la edición CRISPR-Cas9 es predecible, tenemos un parámetro para medir cómo solucionar aún más las mutaciones de la enfermedadprecisamente."
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Materiales proporcionados por Hospital Brigham y de mujeres . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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