El análisis del ADN es útil para una serie de aplicaciones vitales. Esto incluye el diagnóstico y monitoreo de enfermedades, la identificación de delincuentes y el estudio de la función de un segmento específico de ADN. Sin embargo, los métodos utilizados para los análisis a menudo requieren más ADN del que puede estar disponibleen una muestra típica. "Por lo tanto, la amplificación es necesaria, pero no siempre es directa. El método de amplificación o fotocopiado más utilizado es la reacción en cadena de la polimerasa PCR. Un nuevo método de PCR podría ayudar al proceso de amplificación, y así desarrollar ensayos robustos queanteriormente no hubiera sido posible.
El ácido desoxirribonucleico ADN es una molécula que se encuentra en el núcleo de las células y lleva las 'instrucciones' para el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos. A menudo se compara con un conjunto de planos, ya que contiene las instrucciones necesarias para construir células.Estas instrucciones se dividen en segmentos a lo largo de una cadena de ADN.
replicación
El ADN está formado por una doble hélice de dos cadenas complementarias hechas de nucleótidos, una estructura a menudo comparada con una escalera. Cuando es hora de replicarse, las dos cadenas de ADN, o "lados" de la escalera, se desenrollan y se separan.Una enzima llamada ADN polimerasa lee las cadenas individuales y combina las bases complementarias los "peldaños" de la escalera con la cadena original. Se producen nuevas cadenas en ambos lados del ADN original, formando dos hélices dobles de ADN idénticas compuestas de unacadena original y una nueva. Este proceso ocurre en todos los organismos vivos y es la base de la herencia biológica.
PCR
La replicación también puede procesarse artificialmente. A veces llamada "fotocopia molecular", la reacción en cadena de la polimerasa PCR es una técnica rápida y relativamente económica utilizada para amplificar o hacer muchas copias de pequeños segmentos de ADN. Esto es necesario porque los métodosusado para analizar ADN o determinar la secuencia de pares de bases de ADN requiere más ADN del que puede estar en una muestra típica. Por lo tanto, el objetivo con PCR es amplificar una región específica de una cadena de ADN.
Para realizar la PCR, las dos cadenas de la doble hélice de ADN se separan físicamente mediante la aplicación de alta temperatura 93-98 ° C en un proceso llamado fusión de ADN. En el segundo paso, se baja la temperatura y las dos cadenas de ADN,ahora separados, se convierten en plantillas para los llamados cebadores. Los cebadores son moléculas cortas de ADN monocatenario, complementarias a la región de ADN destinada a la amplificación. Después de bajar la temperatura, los cebadores agregados al proceso de PCR encuentran y se unen a su objetivo específico.La enzima llamada ADN polimerasa alargará, o construirá, una nueva cadena de ADN del cebador utilizando la molécula de ADN de cadena sencilla subyacente como plantilla.
Construyendo una escalera
Como se mencionó anteriormente, los cebadores son moléculas cortas de ADN monocatenario. Estas generalmente tienen alrededor de 20 nucleótidos de largo. Esta cadena de nucleótidos, se une específicamente al comienzo de la cadena de plantilla mediante el emparejamiento de bases, encontrando las bases complementarias. Entonces la ADN polimerasa es entoncescapaz de agregar el siguiente nucleótido complementario. La polimerasa continúa agregando más nucleótidos complementarios al ADN molde hasta que se completa una nueva doble cadena de ADN, o para usar la metáfora anterior; se construye una nueva escalera, con un lado original y un lado nuevo.
Los cebadores duales permiten definir con precisión el área de una molécula de ADN que se amplificará mediante la PCR. Estos dos cebadores flanqueantes especifican dónde debe comenzar y terminar la nueva cadena.
Un pequeño cambio de paradigma
Una regla central fuertemente anclada en la mente del científico molecular es que los cebadores deben ser complementarios solo a la secuencia objetivo, y no entre sí. Esto para evitar que los cebadores se usen entre sí como plantillas y, por lo tanto, deshabiliten una posible participación adicional en el objetivo tradicionalamplificación.
En un estudio reciente, publicado en la revista científica PLOS One, el investigador principal Marc Anglès d´Auriac con el Instituto Noruego de Investigación del Agua NIVA muestra que es posible usar cebadores altamente complementarios y evitar las desafortunadas consecuencias mencionadasEl nuevo método se ha denominado COMPAS-PCR, abreviatura de COMplementary Primer Asymmetric PCR.
En resumen, Anglès d'Auriac observó que los cebadores complementarios entre ellos y un objetivo triple superposición aún podían definir un producto de amplificación cuando formaban parte de un motivo o estructura de ADN repetido. Esto se muestra en la figura siguiente.El obstáculo de la amplificación del objetivo debido a la complementariedad del cebador se alivió mediante la introducción de concentraciones asimétricas del cebador. Asimétrico a este respecto significa un número desigual de moléculas entre los dos cebadores. Un cebador consiste en un número bajo de moléculas, el otro con un número alto.
"Si usa concentraciones iguales, como lo hace habitualmente para PCR, los cebadores, presentes en cantidades iguales, se adherirán entre sí", dice Anglès d'Auriac. "Con concentraciones asimétricas, el cebador en exceso o altamente concentrado tiene un númerode moléculas no pegadas con el cebador limitante y, por lo tanto, está disponible para la amplificación objetivo "
trabajando solo
"Este enfoque contraintuitivo aislará, pero también protegerá, el cebador de baja concentración", dice Anglès d'Auriac.
Con el cebador limitante pegado y, por lo tanto, protegido, es posible que el cebador de alta concentración trabaje solo, es decir, haga una copia de un solo filamento del ADN objetivo. Cuando se producen suficientes amplicones de un solo filamento, pueden servircomo material de plantilla para el cebador de baja concentración. Se libera el cebador limitante y la reacción cambia a la amplificación por PCR exponencial clásica.
"Esto aumenta las posibilidades de aplicación de PCR para el científico", aclara Anglès d'Auriac.
estructuras repetitivas
En muchos organismos, una fracción significativa del ADN genómico es altamente repetitiva, y más de la mitad de la secuencia consiste en elementos repetitivos en humanos.
De hecho, fue una estructura de ADN repetitiva que hizo que Anglès d'Auriac pensara fuera de la caja y propusiera el principio COMPAS-PCR, un pequeño cambio de paradigma dentro del campo de la fotocopia molecular.
En el proceso de realizar un diagnóstico de salmónidos basado en el ADN, en particular la identificación de la trucha marrón Salmo trutta y el salmón del Atlántico Salmo salar estrechamente relacionados, Anglès d'Auriac luchó para separar estas especies, incluidos los híbridos entre ellas.y la identificación precisa ayudaría a mejorar el monitoreo y los estudios del ecosistema fluvial, ya que la identificación de híbridos es importante para estimar la salud ecológica de las cuencas fluviales. Después de usar COMPAS-PCR, Anglès d'Auriac pudo aplicar un método de análisis de producto de PCR llamado fusión de alta resoluciónanálisis en la identificación de trucha marrón, salmón del Atlántico y sus híbridos en una prueba.
Sin embargo, Anglès d'Auriac hace hincapié en que el principio COMPAS-PCR no se limita a la identificación de especies de peces. El uso de cebadores casi completamente complementarios dirigidos a la misma secuencia puede aplicarse a cualquier copia que se encuentre adyacente entre sí, en motivos de ADN deinterés como secuencias objetivo.
"Se informa que las secuencias repetidas de ADN comprenden más del 50% del genoma humano y están presentes en muchas familias de genes de" mantenimiento ", como el gen ribosómico 5S utilizado en este estudio. Por lo tanto, los principios generales de COMPAS-PCR ayudarán a desarrollarnuevas estrategias de amplificación de ADN que aprovechan estas estructuras repetidas de ADN ", concluye Marc Anglès d'Auriac.
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Materiales proporcionado por Instituto Noruego de Investigación del Agua NIVA . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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