Los ácidos micro ribonucleicos microARN monocatenarios, no codificantes, que consisten en 18-23 nucleótidos, juegan un papel clave en la regulación de la expresión génica. Los niveles de microARN que circulan en la sangre pueden correlacionarse con diferentes estados de enfermedades como el cáncer, neurodegenerativotrastornos y afecciones cardiovasculares. Muchos microARN dentro de la sangre están encapsulados dentro de exosomas, vesículas a nanoescala liberadas por las células.
La medición precisa de la cantidad de microARN que circula dentro de la sangre es extremadamente difícil debido a su corta longitud, secuencias similares y bajos niveles de concentración. Debido a su pequeño número de nucleótidos, los métodos tradicionales de detección de la reacción en cadena de la polimerasa PCR necesariamente deben involucrar unpaso de ligadura o enlace para producir cadenas de ADN complementarias más largas. Dicha ligadura a menudo produce grandes sesgos
En consecuencia, se requieren grandes volúmenes de muestras clínicas para obtener mediciones precisas, pero pocos sistemas de detección convencionales pueden manejar esto directamente sin la preparación adecuada de la muestra y la reducción de volumen.
Un equipo de investigadores en Italia del Istituto Italiano di Tecnologia y la Universidad de Nápoles Federico II, ambos en Nápoles, se propusieron desarrollar un sistema simple y ultrasensible de detección de fluorescencia de microARN en flujo que utiliza microgeles codificados espectralmente.
Como informa el equipo en Biomicrofluidics, de AIP Publishing, hasta ahora este enfoque de detección de códigos de barras multiplexado solo se ha llevado a cabo en procedimientos de observación que requieren mucho tiempo, lo que dificulta significativamente su posible rendimiento diagnóstico.
"Nuestro logro tecnológico se basa en la implementación directa de una lectura de secuencias de microRNA de interés aparentemente en tiempo real, basada en microfluidos, que se reduce a unos pocos microlitros de volumen objetivo", explicó Filippo Causa, profesor asociado de bioingeniería industrial enDepartamento de Química, Ingeniería de Materiales y Producción Industrial de la Universidad de Nápoles Federico II. "No se requiere amplificación previa de la secuencia de ARN, lo que reduce las fuentes evidentes de errores de medición".
Para hacer esto, los investigadores primero exploraron un fluido no newtoniano rentable y biocompatible para crear la alineación tridimensional óptima de microgeles en el centro de un capilar de vidrio de forma cuadrada.
Luego utilizaron un diseño microfluídico simple para hacer fluir el microgel y permitir una medición continua de la señal de fluorescencia con varias longitudes de onda de emisión para la detección de códigos de barras multiplexados.
"Elegimos microgeles con moléculas emisoras de fluorescencia no superpuestas diseñadas para distinguir los códigos de barras espectrales para el análisis multiplex ... y para obtener una cuantificación absoluta de las secuencias de microARN", dijo Causa. "La alineación precisa de microgel a varias tasas de rendimiento y un microARN automáticoLa normalización de la intensidad de secuencia en el flujo nos da la oportunidad de obtener mediciones confiables, similares a los resultados de medición inactivos, sin pretratamientos fundamentales de la muestra de medición ".
Para probar su concepto de este análisis de microgel espectral multiplex dentro de un flujo microfluídico, el equipo usó "diferentes códigos de barras correspondientes a diferentes emisiones a longitudes de onda específicas y la intensidad de fluorescencia de la concentración conocida de microARN", que se midió para calibraciones del microARN específico que se estáCausa dijo: "Hasta ahora, se han probado nueve códigos de barras de microgel diferentes en flujo con nuestro enfoque de detección, y se están preparando más códigos para multiplexarlo más".
Como prueba de principio, el equipo exploró el microARN basándose en su importancia para la patogénesis de varios tumores malignos, incluidos los cánceres de próstata, gástrico, de colon, de mama y de pulmón.
"Pudimos detectar, contar e identificar específicamente de manera casi en tiempo real cientos de microgeles ~ 80 partículas de microgel por minuto en volúmenes de muestra de solo unos pocos microlitros", dijo Causa. "Nuestro sistema logró unlímite de detección de microARN de 202 femtoMolares en condiciones de flujo microfluídico "
Las mediciones se realizaron con diferentes códigos de barras de microgel y uno en particular enfocado en objetivos específicos de microARN, demostrando la especificidad del ensayo para condiciones de medición multiplex.
"Se detectó una concentración de microARN 21 de 0,74 picomolares en el flujo, que es consistente con el nivel de concentración inicial de la muestra", dijo Causa. "De tales adquisiciones de fluorescencia, fue posible una cuantificación absoluta del nivel de concentración de microARN 21".
En términos de aplicaciones para el sistema, dado que la detección específica de microgeles se puede ajustar fácilmente, se puede aplicar a una amplia gama de biomarcadores diferentes gracias a su estructura de código de barras.
"Los usuarios también pueden ajustar fácilmente su velocidad de lectura específicamente para cualquier sistema microscópico", dijo Causa. "Esto significa que el sistema abrirá nuevas opciones para biosensores de partículas dentro de dispositivos microfluídicos".
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Instituto Americano de Física AIP . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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