Los investigadores han desarrollado un nuevo enfoque de microscopía de fluorescencia que mejora significativamente la resolución de la imagen al adquirir tres vistas de una muestra al mismo tiempo. Su nuevo método es particularmente útil para observar la dinámica de los procesos biológicos, que pueden proporcionar información sobre cómo funcionan las células sanasy qué sale mal cuando se producen enfermedades.
En el diario de The Optical Society para investigación de alto impacto óptica , los investigadores aplican su técnica de múltiples vistas en dos modos de microscopía y la usan para obtener imágenes de varios tipos de muestras biológicas. Para ambos modos, los investigadores demostraron una resolución volumétrica de hasta 235 por 235 por 340 nanómetros, el doble de la resolución volumétricade métodos tradicionales.
Los biólogos usan comúnmente la microscopía de fluorescencia para estudiar todo, desde el desarrollo del embrión hasta los intrincados procesos dentro de las células vivas. Sin embargo, la mayoría de los métodos de microscopía de fluorescencia no capturan gran parte de la fluorescencia emitida por la muestra, lo que no solo representa información perdida sino que también reduce la resolución de la imagen.
"En nuestro trabajo, capturamos esta fluorescencia previamente descuidada y la fusionamos con los puntos de vista tradicionales utilizados en la microscopía convencional", dijo Yicong Wu, científico del Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería, Institutos Nacionales de Salud, Maryland, EE. UU.y primer autor de la óptica papel. "Esto aumenta la resolución sin comprometer la resolución temporal ni agregar luz adicional a la muestra".
Agregar un tercer objetivo
El nuevo enfoque de múltiples vistas ayuda a mejorar una técnica que los investigadores desarrollaron anteriormente llamada microscopía de iluminación de plano de doble vista diSPIM. Los científicos de todo el mundo emplean versiones comerciales de diSPIM, que utiliza una delgada lámina de luz y lentes de dos objetivos para excitary detectar fluorescencia.
"La principal motivación de esta nueva investigación fue que la resolución en diSPIM estaba limitada por la apertura numérica de las lentes superiores, y la fluorescencia emitida en la dirección del cubreobjetos no se captura", explicó Hari Shroff, líder del equipo de investigación"Pensamos que si pudiéramos obtener imágenes de esta señal descuidada al mismo tiempo agregando una lente de mayor apertura numérica que adquiriera la vista inferior, entonces podríamos aumentar la resolución lateral".
En la técnica de microscopía diSPIM mejorada, cada hoja de luz se inclina en un ángulo de 45 grados con respecto a una lente objetivo inferior adicional. En su diseño actual, los investigadores barrieron el plano de enfoque del objetivo inferior a través de la muestra para obtener imágenes de lo que no se había utilizado previamentefluorescencia, pero este escaneo mecánico podría reemplazarse con una óptica pasiva en futuras versiones del microscopio. El uso del enfoque de múltiples vistas mejoró la resolución lateral u horizontal de diSPIM a aproximadamente 235 nm.
Los investigadores también implementaron la nueva técnica en modo de campo amplio al escanear los tres objetivos a través de una muestra simultáneamente para producir tres vistas 3D individuales. Con este modo, el método de vista múltiple mejoró la resolución axial o del eje Z paraaproximadamente 340 nm, un aumento del 45%.
Fusionando tres vistas en una
Ya sea que se haya adquirido en modo de campo amplio o de hoja de luz, las tres vistas deben alinearse con precisión y también limpiarse con una técnica de procesamiento de imágenes conocida como deconvolución.
"Un truco útil fue desconvolver cada vista primero para aumentar la calidad de la imagen, el contraste, etc., lo que luego permitió el registro preciso de las tres vistas", dijo Wu. "En el modo de campo amplio, ayudamos aún más al registro de la vistaimágenes agregando cuentas fluorescentes a las muestras como punto de referencia ". Agregó que la colaboración con el grupo de investigación de Patrick La Riviere en la Universidad de Chicago fue esencial para pensar y probar este método de desconvolución.
Los investigadores demostraron la técnica de múltiples vistas al obtener imágenes biológicas de las muestras y pudieron ver características detalladas que normalmente no son observables. Por ejemplo, el microscopio de múltiples vistas de campo amplio resolvió claramente la cubierta de proteína esférica presente cuando Bacillus subtilis forma una espora yTambién permitió a los investigadores observar la dinámica de los orgánulos dentro de las células. En el modo de hoja de luz, vieron claramente la naturaleza dinámica en 3D de pequeñas protuberancias en los glóbulos blancos vivos cuando adquirieron 150 imágenes de triple vista en 40 minutos.
Aunque se han utilizado otros métodos para capturar múltiples vistas secuencialmente, este nuevo método mejora la resolución espacial sin introducir iluminación adicional o comprometer la resolución temporal en relación con las imágenes convencionales. Esto es importante porque la luz adicional puede ser perjudicial, incluso mortal para las células vivas, yla resolución temporal es necesaria para capturar procesos rápidos.
El equipo de investigación ahora está explorando aplicaciones biológicas adicionales para el nuevo sistema y está trabajando para extender el método a otras modalidades de microscopio, como la microscopía confocal.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionados por La sociedad óptica . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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