Ryohei Yasuda, Ph.D. y su equipo en el Instituto de Neurociencia Max Planck Florida MPFI están trabajando para comprender la forma en que las células de nuestro cerebro cambian a medida que aprendemos y formamos recuerdos. Pero la investigación en esta área ha sido limitada debido adebido a la falta de técnicas que permitan a los científicos localizar y visualizar proteínas individuales dentro de una sola neurona. Los métodos actuales de obtención de imágenes no brindan especificidad, contraste y resolución lo suficientemente potentes para ver proteínas distintas. Además, consumen mucho tiempo y son costosos; puede llevar un tiempoaño o dos para desarrollar los modelos diseñados. Pero cuando el investigador Jun Nishiyama, MD, Ph.D. e investigador postdoctoral, y Takayasu Mikuni, MD, Ph.D., leyeron sobre CRISPR / Cas9, un innovador ADNtécnica de edición desarrollada en 2014, tuvieron una idea.
CRISPR es una herramienta integrada en el ADN de las bacterias que los organismos unicelulares utilizan para combatir las infecciones. Cuando un virus invade e intenta insertar su ADN infeccioso en el de una célula bacteriana, se crea una sección especial del ADN bacteriano, llamadaCRISPR, corta el ADN viral y lo hace incapaz de causar estragos. Los científicos han comenzado a usar CRISPR / Cas9 para dañar genes específicos en células y organismos distintos de las bacterias. Cuando se produce este daño, hay dos métodos que la célula utiliza para reparar suADN. Una es la reparación dirigida por homología HDR, la otra es la unión de extremos no homólogos NHEJ. La HDR es mucho más precisa y reconstruye o reemplaza el gen dañado, mientras que NHEJ degrada el gen dañado y vuelve a unir los extremos de lo que queda, a menudo eliminando la expresión del gen dañado, pero no reemplazándolo.
Si una célula usa HDR para repararse a sí misma, los científicos pueden incluir un gen deseado en el sistema CRISPR que se insertará en el ADN para reemplazar el gen dañado. Muchos investigadores creen que una vez que una célula deja de dividirse, generalmente usa NHEJ, en su lugarde HDR, para reparar cualquier ADN roto.
A pesar del impresionante poder del sistema CRISPR, ha habido poco éxito en la manipulación del ADN en las células cerebrales, porque cuando el cerebro se ha formado, sus células ya no se están dividiendo. Mientras que los científicos pueden usar CRISPR con relativa facilidad para eliminar ciertosgenes en el cerebro, la falta de división celular ha hecho que sea muy difícil para ellos detectar los genes deseados, a través de HDR, con precisión confiable.
Yasuda y su equipo desarrollaron un método, al que denominan SLENDR etiquetado unicelular de proteínas endógenas mediante reparación dirigida por homología mediada por CRISPRCas9, que se puede utilizar para modificar con precisión el ADN neuronal en muestras vivas. En modelos experimentales, elEl equipo utilizó la electroporación en el útero, una técnica que les permitió insertar el sistema CRISPR / Cas9 en las células cerebrales prenatales que aún se están desarrollando y dividiendo. Por lo tanto, el ADN roto aún se está reparando a través de HDR, lo que permite a los investigadores agregar un gen que hizouna proteína de interés visible bajo el microscopio. Incluso pudieron etiquetar de manera confiable dos proteínas diferentes con colores distintos al mismo tiempo en la misma célula. Los investigadores utilizaron una variedad de métodos de obtención de imágenes, así como secuenciación de ADN para confirmar que el método SLENDRhabía golpeado verdadera y precisamente los genes.
Mientras probaba la nueva técnica, el equipo observó un comportamiento no descrito previamente de la isoforma alfa de la proteína quinasa C. Al principio del desarrollo, aproximadamente 7 días después del nacimiento, se encontró agrupada en la membrana de la célula, lo que sugiere que era muy activa., mientras que un mes después del nacimiento, se diseminó de manera difusa por toda la célula, lo que sugiere que no permaneció muy activo más adelante en el desarrollo.
"Creo que SLENDR será una herramienta estándar para la neurobiología molecular y celular", dijo Yasuda. "SLENDR proporciona un medio valioso para determinar la localización subcelular de proteínas y ayudará a los investigadores a determinar la función de las proteínas".
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Materiales proporcionado por Instituto Max Planck de Florida para Neurociencias . Nota: el contenido se puede editar por estilo y longitud.
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