Los biólogos de Caltech han modificado un virus inofensivo de tal manera que puede ingresar con éxito al cerebro del ratón adulto a través del torrente sanguíneo y entregar genes a las células del sistema nervioso. El virus podría ayudar a los investigadores a mapear las complejidades del cerebro y es prometedor parala entrega de nuevas terapias para tratar enfermedades como el Alzheimer y Huntington. Además, el enfoque de detección que los investigadores desarrollaron para identificar el virus podría usarse para crear vectores adicionales capaces de atacar las células en otros órganos.
"Al descubrir una forma de hacer que los genes atraviesen la barrera hematoencefálica, podemos distribuirlos en todo el cerebro adulto con alta eficiencia", dice Ben Deverman, científico investigador de Caltech y autor principal de un artículo que describeel trabajo en la publicación en línea del 1 de febrero de la revista Biotecnología de la naturaleza .
La barrera hematoencefálica permite que el cuerpo evite que los patógenos y las sustancias químicas potencialmente dañinas que circulan en la sangre ingresen al cerebro y la médula espinal. El bloqueo semipermeable, compuesto por células compactas, es crucial para mantener un ambiente controlado que permitael sistema nervioso central para funcionar correctamente. Sin embargo, la barrera también hace que sea casi imposible que muchas drogas y otras moléculas se envíen al cerebro a través del torrente sanguíneo.
Para escabullir genes más allá de la barrera hematoencefálica, los investigadores de Caltech usaron una nueva variante de un virus pequeño e inofensivo llamado virus adenoasociado AAV. Durante las últimas dos décadas, los investigadores han usado varios AAV como vehículos para transportargenes específicos en los núcleos de las células; una vez allí, los genes pueden expresarse o traducirse del ADN a proteínas. En algunas aplicaciones, los AAV llevan copias funcionales de genes para reemplazar las formas mutadas presentes en individuos con enfermedades genéticas. En otras aplicaciones, se usan para administrar genes que proporcionan instrucciones para generar moléculas como anticuerpos o proteínas fluorescentes que ayudan a los investigadores a estudiar, identificar y rastrear ciertas células.
En gran parte debido al problema de la barrera hematoencefálica, los científicos han tenido un éxito limitado en la entrega de AAV y su carga genética al sistema nervioso central. En general, se han basado en inyecciones quirúrgicas, que administran altas concentraciones del virus en la inyecciónsitio pero poco a las áreas periféricas. Tales inyecciones también son bastante invasivas. "Uno tiene que perforar un agujero a través del cráneo, luego perforar el tejido con una aguja en el sitio de inyección", explica Viviana Gradinaru BS '05, profesora asistente de biologíae ingeniería biológica en Caltech y autor principal del artículo: "Cuanto más profunda es la inyección, mayor es el riesgo de hemorragia. Con la inyección sistémica, usando el torrente sanguíneo, ninguno de esos daños ocurre, y el parto es más uniforme".
Además, señala Gradinaru, "muchos trastornos no están muy localizados. Los trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Huntington afectan áreas cerebrales muy grandes. Además, muchas conductas complejas están mediadas por redes de interacción distribuidas. Nuestra capacidad para atacar esas redes es clave en términos denuestros esfuerzos por comprender qué están haciendo esas vías y cómo mejorarlas cuando no funcionan bien "
En 2009, un grupo dirigido por Brian Kaspar de la Universidad Estatal de Ohio publicó un artículo, también en Biotecnología de la naturaleza , que muestra que una cepa de AAV llamada AAV9 inyectada en el torrente sanguíneo podría llegar al cerebro, pero solo fue eficiente cuando se usó en ratones neonatales o bebés.
"El gran desafío era cómo lograr la misma eficiencia en un adulto", dice Gradinaru.
Aunque a uno le gustaría diseñar un AAV que esté a la altura de la tarea, la cantidad de variables que dictan el comportamiento de cualquier virus dado, así como las complejidades del cerebro y su barrera, lo hacen extremadamente desafiante.los investigadores desarrollaron un ensayo de selección de alto rendimiento, CREATE Cre REcombinase-based AAV Targeted Evolution, que les permitió probar millones de virus in vivo simultáneamente e identificar aquellos que eran mejores para ingresar al cerebro y entregar genes a una clase específica decélulas cerebrales conocidas como astrocitos.
Comenzaron con el virus AAV9 y modificaron un fragmento de gen que codifica un pequeño asa en la superficie de la cápside, la cubierta proteica del virus que envuelve todo el material genético del virus. Utilizando una técnica de amplificación común, conocidacomo reacción en cadena de la polimerasa PCR, crearon millones de variantes virales. Cada variante llevaba dentro las instrucciones genéticas para producir más cápsides como él mismo.
Luego utilizaron su novedoso proceso de selección para determinar qué variantes entregan los genes más efectivamente a los astrocitos en el cerebro. Es importante destacar que el nuevo proceso se basa en posicionar estratégicamente el gen que codifica las variantes de la cápside en la cadena de ADN entre dos secuencias cortas de ADN, conocidascomo sitios lox. Estos sitios son reconocidos por una enzima llamada Cre recombinasa, que se une a ellos e invierte la secuencia genética entre ellos. Al inyectar los virus modificados en ratones transgénicos que solo expresan la recombinasa Cre en los astrocitos, los investigadores sabían que cualquier secuencia marcabapor la inversión del sitio lox había transferido con éxito su carga genética al tipo de célula objetivo, aquí, los astrocitos.
Después de una semana, los investigadores aislaron el ADN del cerebro y el tejido de la médula espinal y amplificaron las secuencias marcadas, recuperando así solo las variantes que habían ingresado a los astrocitos.
Luego, tomaron esas secuencias y las volvieron a insertar en el genoma viral modificado para crear una nueva biblioteca que podría inyectarse en el mismo tipo de ratones transgénicos. Después de solo dos rondas de inyección y amplificación, surgieron un puñado de variantes comoaquellos que fueron mejores para cruzar la barrera hematoencefálica y entrar a los astrocitos.
"Pasamos de millones de virus a un puñado de resultados probables y potencialmente útiles por los que podríamos pasar sistemáticamente y ver cuáles surgieron con propiedades deseables", dice Gradinaru.
A través de este proceso de selección, los investigadores identificaron una variante denominada AAV-PHP.B como de alto rendimiento. Le dieron al virus su acrónimo en honor al fallecido biólogo Caltech Paul H. Patterson porque Deverman comenzó este trabajo en el grupo de Patterson ".Paul tenía el compromiso de comprender los trastornos cerebrales y vio el valor de impulsar el desarrollo de herramientas ", dice Gradinaru, quien también trabajó en el laboratorio de Patterson como estudiante universitario.
Para probar AAV-PHP.B, los investigadores lo usaron para administrar un gen que codifica una proteína que brilla en verde, lo que facilita la visualización de las células que lo expresan. Inyectaron el AAV-PHP.B o AAV9 comoun control en diferentes ratones adultos y después de tres semanas usó la cantidad de fluorescencia verde para evaluar la eficacia con la que los virus ingresaron al cerebro, la médula espinal y la retina.
"Pudimos ver que AAV-PHP.B se expresó en todo el sistema nervioso central del adulto con alta eficiencia en la mayoría de los tipos de células", dice Gradinaru. De hecho, en comparación con AAV9, AAV-PHP.B entrega genes al cerebro y la columna vertebralcable al menos 40 veces más eficiente.
"Lo que proporciona la mayor parte del beneficio de AAV-PHP.B es su mayor capacidad para atravesar la vasculatura en el cerebro", dice Deverman. "Una vez allí, muchos AAV, incluido el AAV9, son bastante buenos para enviar genes a las neuronas y glía."
Gradinaru señala que dado que AAV-PHP.B se administra a través del torrente sanguíneo, llega a otras partes del cuerpo. "Aunque en este estudio nos enfocamos en el cerebro, también pudimos usar la limpieza de tejido de todo el cuerpo para observaren su biodistribución en todo el cuerpo ", dice ella.
La eliminación de tejido de todo el cuerpo por PARS CLARITY, una técnica desarrollada previamente en el laboratorio Gradinaru para hacer que los tejidos de mamíferos normalmente opacos sean transparentes, permite que los órganos sean examinados sin la laboriosa tarea de hacer secciones finas montadas en portaobjetos.para detectar más rápidamente los vectores virales para aquellos que se dirigen mejor a las células y órganos de interés.
"En este caso, la prioridad era expresar el gen en el cerebro, pero podemos ver mediante la limpieza de todo el cuerpo que realmente puede tener expresión en muchos otros órganos e incluso en los nervios periféricos", explica Gradinaru ".Al hacer que los tejidos sean transparentes y mirar a través de ellos, podemos obtener más información sobre estos virus e identificar objetivos que de otro modo podríamos pasar por alto ".
Los biólogos realizaron estudios de seguimiento hasta un año después de las inyecciones iniciales y descubrieron que la proteína continuaba expresándose eficientemente. Dicha expresión a largo plazo es importante para los estudios de terapia génica en humanos.
En colaboración con colegas de la Universidad de Stanford, Deverman y Gradinaru también demostraron que AAV-PHP.B es mejor que AAV9 en la entrega de genes a las neuronas y glía humanas.
Los investigadores esperan comenzar a probar la capacidad de AAV-PHP.B para administrar genes potencialmente terapéuticos en modelos de enfermedades. También están trabajando para evolucionar aún más el virus para hacer variantes aún mejores y producir variantes que se dirigen a ciertos tipos de células con más especificidad.
Deverman dice que el sistema CREATE podría aplicarse para desarrollar AAV capaces de administrar genes específicamente a muchos tipos de células diferentes. "Hay cientos de líneas transgénicas Cre diferentes disponibles", dice. "Los investigadores han puesto la recombinasa Cre bajo el controlde elementos reguladores de genes para que solo se produzca en ciertos tipos de células, lo que significa que independientemente de si su objetivo es apuntar a las células hepáticas o a un tipo particular de neurona, casi siempre puede encontrar un ratón que tenga la recombinasa Cre expresada en esas células"
"El sistema CREATE nos dio un buen éxito desde el principio, pero estamos entusiasmados con el potencial futuro de usar este enfoque para generar virus que tengan muy buena especificidad de tipo celular en diferentes organismos, especialmente los menos genéticamente tratables", diceGradinaru: "Este es solo el primer paso. Podemos llevar estas herramientas y conceptos en muchas direcciones interesantes para mejorar aún más este trabajo, y nosotros, con el Instituto Beckman y sus colaboradores, estamos listos para aprovechar esas posibilidades".
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Instituto de Tecnología de California . Original escrito por Kimm Fesenmaier. Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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