Los científicos ahora pueden ver procesos biológicos dinámicos con una claridad sin precedentes en las células vivas utilizando nuevas técnicas de imagen desarrolladas por investigadores del Campus de Investigación Janelia del Instituto Médico Howard Hughes. Los nuevos métodos mejoran drásticamente la resolución espacial proporcionada por la microscopía de iluminación estructurada, una de lasmejores métodos de imágenes para ver dentro de las células vivas.
Los videos vibrantes producidos con la nueva tecnología muestran el movimiento y las interacciones de las proteínas a medida que las células remodelan sus soportes estructurales o reorganizan sus membranas para absorber moléculas del exterior de la célula. El líder del grupo Janelia Eric Betzig, el compañero postdoctoral Dong Li y sus colegas hanSe agregaron las dos nuevas tecnologías, ambas variaciones en SIM, al conjunto de herramientas disponibles para imágenes de súper resolución: la microscopía óptica de súper resolución produce imágenes cuya resolución espacial supera el límite teórico impuesto por la longitud de onda de la luz, ofreciendo detalles visuales extraordinarios.de estructuras dentro de las células. Pero hasta ahora, los métodos de superresolución han sido poco prácticos para su uso en la obtención de imágenes de células vivas.
"Estos métodos establecen un nuevo estándar de hasta qué punto puede impulsar la velocidad y la no invasividad de las imágenes de súper resolución", dice Betzig sobre las técnicas que su equipo describió en la edición del 28 de agosto de 2015 de la revista ciencia . "Esto traerá súper resolución a la imagen de células vivas de verdad"
En SIM tradicional, la muestra debajo de la lente se observa mientras está iluminada por un patrón de luz más parecido a un código de barras que la luz de una lámpara. Se aplican varios patrones de luz diferentes y se capturan los patrones de moiré resultantesLa cámara digital extrae la información en las imágenes de muaré y la traduce en una reconstrucción tridimensional de alta resolución. La reconstrucción final tiene el doble de la resolución espacial que se puede obtener con la microscopía de luz tradicional..
Betzig fue uno de los tres científicos galardonados con el Premio Nobel de Química 2014 por el desarrollo de la microscopía de fluorescencia superresuelta. Dice que SIM no ha recibido tanta atención como otros métodos de superresolución en gran parte porque esos otros métodos ofrecen ganancias más dramáticas enresolución espacial, pero señala que SIM siempre ha ofrecido dos ventajas sobre los métodos alternativos de superresolución, incluida la microscopía de localización fotoactivada PALM, que desarrolló en 2006 con el colega de Janelia Harald Hess.
Tanto la microscopía PALM como la de estimulación de emisión estimulada STED, la otra técnica de súper resolución reconocida con el Premio Nobel 2014, iluminan las muestras con tanta luz que las proteínas marcadas con fluorescencia se desvanecen y la muestra se daña rápidamente, lo que hace imposible una imagen prolongada., sin embargo, es diferente: "Me enamoré de SIM debido a su velocidad y al hecho de que tomó mucha menos luz que los otros métodos", dice Betzig.
Betzig comenzó a trabajar con SIM poco después de la muerte en 2011 de uno de sus pioneros, Mats Gustafsson, que era un líder de grupo en Janelia. Betzig ya estaba convencido de que SIM tenía el potencial de generar ideas significativas sobre el funcionamiento interno de las células,y sospechaba que mejorar la resolución espacial de la técnica contribuiría en gran medida a aumentar su uso por parte de los biólogos.
Gustafsson y el estudiante graduado Hesper Rego habían logrado SIM de mayor resolución con una variación llamada SIM no lineal de agotamiento saturado, pero ese método intercambia mejoras en la resolución espacial para condiciones más severas y una pérdida de velocidad. Betzig vio una forma de evitar ese intercambio-apagado.
El agotamiento saturado mejora la resolución de las imágenes SIM al aprovechar las etiquetas de proteínas fluorescentes que pueden encenderse y apagarse con luz. Para generar una imagen, todas las etiquetas fluorescentes en una proteína se encienden, luego se activa una onda de luzsolía desactivar la mayoría de ellos. Después de la exposición a la luz desactivadora, solo las moléculas en las regiones más oscuras de la onda de luz continúan fluorescentes. Esto proporciona información de mayor frecuencia y agudiza la imagen resultante. Se captura una imagen y el ciclo se repite 25 veceso más para generar datos para la imagen final. El principio es muy similar a la forma en que se logra la superresolución en STED o un método relacionado llamado RESOLFT, dice Betzig.
El método no es adecuado para imágenes en vivo, dice, porque lleva demasiado tiempo encender y apagar las moléculas fotoactivables. Además, la exposición repetida a la luz daña las células y sus etiquetas fluorescentes ". El problema con este enfoque es queprimero enciendes todas las moléculas, luego inmediatamente apagas casi todas las moléculas. Las moléculas que has apagado no contribuyen en nada a la imagen, pero las has freído dos veces. Estás estresando las moléculas,y lleva mucho tiempo, que no tienes, porque la celda se está moviendo "
La solución era simple, Betzig dice: "No encienda todas las moléculas. No hay necesidad de hacer eso". En cambio, el nuevo método, llamado SIM no lineal con fotoactivación modelada, comienza por encender solo un subconjuntode etiquetas fluorescentes en una muestra con un patrón de luz. "El patrón de eso ya le da información de alta resolución", explica. Se utiliza un nuevo patrón de luz para desactivar las moléculas, y se lee información adicional de su desactivación.El efecto combinado de esos patrones conduce a imágenes finales con una resolución de 62 nanómetros, mejor que la SIM estándar y una mejora de tres veces sobre los límites impuestos por la longitud de onda de la luz.
"Podemos hacerlo y podemos hacerlo rápido", dice. Eso es importante, dice, porque para los procesos dinámicos de imágenes, un aumento en la resolución espacial no tiene sentido sin un aumento correspondiente en la velocidad ". Si algo en la celdase mueve a una micra por segundo y tengo una resolución de una micra, puedo tomar esa imagen en un segundo. Pero si tengo una resolución de 1/10 de micra, tengo que tomar los datos en una décima de segundo, o de lo contrariose manchará ", explica.
SIM no lineal de fotoactivación con dibujos captura las 25 imágenes que entran en una reconstrucción final en aproximadamente un tercio de segundo. Debido a que lo hace de manera eficiente, utilizando luz de baja intensidad e información de cada fotón emitido por las etiquetas fluorescentes de una muestra,las etiquetas se conservan para que el microscopio pueda obtener imágenes por más tiempo, lo que permite a los científicos observar cómo se desarrolla más acción.
El equipo usó SIM no lineal de fotoactivación estampada para producir videos que muestran que las proteínas estructurales se descomponen y se vuelven a montar a medida que las células se mueven y cambian de forma, así como la dinámica de pequeños hoyos en las superficies celulares llamadas caveolas.
El equipo de Betzig también informa en el artículo de Science que pueden aumentar la resolución espacial de SIM a 84 nanómetros mediante imágenes con un objetivo de microscopio disponible comercialmente con una apertura numérica ultra alta. La apertura restringe la exposición a la luz a una fracción muy pequeña de unmuestra, lo que limita el daño a las células y las moléculas fluorescentes, y el método se puede utilizar para obtener imágenes de varios colores al mismo tiempo, para que los científicos puedan rastrear simultáneamente varias proteínas diferentes.
Utilizando el enfoque de apertura numérica alta, el equipo de Betzig pudo observar los movimientos e interacciones de varias proteínas estructurales durante la formación de adherencias focales, enlaces físicos entre el interior y el exterior de una célula. También siguieron el crecimiento y la internalización de la clatrina-recubiertas, estructuras que facilitan la ingesta de moléculas desde el exterior de la célula. Su análisis cuantitativo respondió a varias preguntas sobre la distribución de las fosas y la relación entre el tamaño de las fosas y la vida útil que no se pudieron abordar con los métodos de imagen anteriores.
Finalmente, al combinar el enfoque de alta apertura numérica con SIM no lineal fotoactivable con diseño, Betzig y sus colegas pudieron seguir dos proteínas a la vez con una resolución más alta que el enfoque de alta apertura numérica que se ofrece por sí solo.
El equipo de Betzig continúa desarrollando sus tecnologías SIM y dice que es probable que se realicen mejoras adicionales. También están ansiosos por trabajar con biólogos para continuar explorando aplicaciones potenciales y refinar la usabilidad de sus técnicas.
Por ahora, los científicos que quieran experimentar con los nuevos métodos SIM pueden hacer los arreglos para hacerlo a través del Centro de imágenes avanzadas de Janelia, que proporciona acceso a la tecnología de microscopía de vanguardia sin costo alguno. Eventualmente, dice Betzig, debería ser bastante sencillohacer que las tecnologías SIM sean accesibles y asequibles para otros laboratorios. "La mayor parte de la magia está en el software, no en el hardware", dice.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Instituto Médico Howard Hughes HHMI . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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