La simplicidad del muestreo de orina se ha combinado con las excelentes capacidades de detección de CRISPR para mejorar las pruebas de diagnóstico para pacientes con trasplante de riñón, informa un equipo de investigación internacional en la revista Nature Biomedical Engineering.
La nueva prueba examina dos virus oportunistas comunes que infectan a pacientes con trasplante de riñón, citomegalovirus CMV y poliomavirus BK BKV y ARNm de CXCL9, cuya expresión aumenta durante el rechazo de trasplante de riñón celular agudo.
"La mayoría de las personas piensan en la edición de genes cuando piensan en CRISPR, pero esta herramienta tiene un gran potencial para otras aplicaciones, especialmente diagnósticos más baratos y más rápidos", dijo el Dr. Michael Kaminski, quien dirige el Laboratorio de Ingeniería de Células Renales y CRISPR en el Laboratorio de DiagnósticoCentro Max Delbrück de Medicina Molecular en la Asociación Helmholtz MDC y Charité - Universitätsmedizin Berlin. Encabezó el desarrollo de la prueba mientras estaba en el laboratorio Collins en el Instituto de Tecnología de Massachusetts MIT. Desde 2020 Kaminski, quien es médico enEl Departamento Médico de Charité, División de Nefrología y Medicina Interna de Cuidados Intensivos, inició un nuevo laboratorio en el Instituto de Biología Molecular de Sistemas de Berlín BIMSB del MDC.
Necesidad crítica
Los pacientes con trasplante de riñón toman medicamentos que inhiben su sistema inmunitario para reducir la posibilidad de que el órgano sea rechazado. Pero esto aumenta su riesgo de enfermarse de infecciones. El monitoreo minucioso de la infección y el rechazo de los pacientes es crítico y guía el delicado equilibrio de la atenciónPor lo general, esto se realiza mediante análisis de sangre y biopsias renales, que requieren mucho tiempo, son más invasivas y caras.
Si bien las pruebas de diagnóstico asequibles a base de orina están disponibles para una variedad de biomarcadores, desde la diabetes hasta el embarazo, no se han adaptado ampliamente para los ácidos nucleicos, como el ADN o el ARN. Ahí es donde entra CRISPR.
La tecnología CRISPR es capaz de encontrar segmentos muy pequeños de una secuencia de ADN o ARN guiados por una pieza complementaria de ARN. Funciona en conjunto con ciertos tipos de proteínas Cas, que cortan la secuencia objetivo, así como una molécula indicadora fluorescente.Esta denominada división colateral libera fluorescencia, lo que indica la presencia de un objetivo. Muchos laboratorios han estado investigando el potencial de diagnóstico de CRISPR en material sintético, pero pocos han analizado muestras clínicas reales.
"El desafío es llegar a concentraciones que sean clínicamente significativas", dijo Kaminski. "Realmente hace una gran diferencia si estás apuntando a una tonelada de objetivo sintético en tu tubo de ensayo, en lugar de si quieres llegar al singlenivel de molécula en un fluido del paciente "
Positivo o negativo
El kit de prueba, formalmente llamado ensayo, utiliza un proceso de dos pasos. Primero, el ADN viral objetivo en una muestra de orina debe amplificarse, copiarse suficientes veces para que CRISPR pueda detectarlo incluso si solo hay una molécula objetivo presente.El equipo utilizó un protocolo específico CRISPR-Cas13 conocido como SHERLOCK para optimizar el proceso de ADN viral. Los resultados se transmiten de manera muy similar a una prueba de embarazo en el hogar. Cuando se sumerge una tira de papel en la muestra preparada, si solo aparece una línea en la tira, el resultado es negativo, mientras que dos líneas indican que hay un virus presente. "Es emocionante ver que los resultados aparecen en las tiras reactivas", dijo Robert Greensmith, un estudiante de doctorado de primer año en el laboratorio de Kaminiski y coautor de papel ".Alguien nuevo en trabajar con CRISPR, estoy impresionado por cómo se convierte en una plataforma de prueba tan robusta ".
Para concentraciones objetivo muy bajas, a menudo aparece una segunda línea pálida en la tira reactiva, lo que podría causar confusión. Por lo tanto, el equipo desarrolló una aplicación para teléfonos inteligentes que analiza imparcialmente las imágenes de la tira reactiva y realiza la llamada final en función de la intensidad de la línea.
Los investigadores utilizaron un proceso similar para el marcador de rechazo CXCL9. Allí, el ARNm se aisló y amplificó, seguido de la detección de objetivo mediada por CRISPR-Cas13.
Después de mucho trabajo para optimizar la técnica, los investigadores utilizaron su análisis para analizar más de 100 muestras de pacientes con trasplante de riñón. El análisis fue muy preciso incluso con bajos niveles de infección por BKV o CMV, y detectó correctamente signos de células agudasrechazo de trasplante.
Próximos pasos
Mientras una solicitud de patente está pendiente, Kaminski, que es médico e investigador clínico, está interesado en estudios clínicos más grandes que comparen el ensayo con los métodos de monitoreo convencionales. También le gustaría investigar formas de hacer que la prueba sea aún más ágil.ahora, las muestras deben calentarse para la preparación y la prueba requiere múltiples pasos. Si bien podría usarse en un entorno hospitalario, aún no está lista para las pruebas en el hogar. El objetivo final es un proceso de un solo paso que pueda medir cuantitativamente múltiples parámetrosDe esa forma, los pacientes pueden medir cambios específicos contra sus líneas de base individuales.
Kaminski señala que esta prueba también podría ser útil para otras personas inmunocomprometidas en riesgo de infecciones virales, mientras que el enfoque de diagnóstico basado en CRISPR podría adaptarse para otros trasplantes de órganos.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Centro Max Delbrück de Medicina Molecular en la Asociación Helmholtz . Original escrito por Laura Petersen. Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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