Los investigadores han estado utilizando el análisis de "hibridación in situ de fluorescencia" FISH durante décadas para buscar literalmente secuencias específicas de ADN y ARN en células y tejidos intactos dentro de sus vastos mares de moléculas de ácido nucleico. Debido a su capacidad para iluminar secuencias específicasbajo el microscopio en los lugares exactos en los que residen, FISH se ha convertido en un método de referencia en el diagnóstico de anomalías cromosómicas, investigación de la organización 3D de los genomas en los núcleos de las células, análisis de los productos inmediatos de la expresión genética conocidacomo ARN mensajero y más.
Sin embargo, sigue siendo un desafío captar secuencias con FISH que son raras, especialmente en tejidos gruesos que emiten una fluorescencia de fondo inespecífica, y detectar muchos objetivos al mismo tiempo en análisis multiplexados. Se han desarrollado varios métodos que pueden amplificar FISH más débilseñales, pero no se pueden personalizar fácilmente, no pueden visualizar simultáneamente una gran cantidad de moléculas diana de ADN o ARN y son costosas y difíciles de usar.
Un equipo de investigación colaborativo del Instituto Wyss de Harvard para la Ingeniería de Inspiración Biológica y la Escuela de Medicina de Harvard HMS ha desarrollado ahora "Amplificación de señal por reacción de intercambio" SABRE, un método práctico y altamente programable que mejora significativamente la sensibilidad y la personalizacióny capacidades de multiplexación del análisis FISH. El equipo demostró que SABRE amplifica las señales FISH en distintos objetivos de ARN y ADN en las diferentes capas de la retina del ratón, y visualiza hasta 17 regiones objetivo diferentes en el cromosoma X humano simultáneamente. Además, utilizaronSABRE como herramienta eficaz para identificar un elemento genómico que controla la transcripción de un gen específico expresado en un tipo particular de neurona retiniana. Su estudio está publicado en Métodos de la naturaleza .
"Con el análisis FISH amplificado por SABRE y su sensibilidad, potencial de multiplexación, practicidad y rentabilidad, creamos una manera de superar las limitaciones clave de los métodos existentes y brindar a los investigadores un manejo más poderoso en un amplio espectro de análisis, que van desdeinvestigación fundamental, hasta el descubrimiento de biomarcadores y el desarrollo de terapias ", dijo Peng Yin, Ph.D., miembro de la facultad de Wyss Institute Core, quien correspondió al estudio junto con Constance Cepko, Ph.D., profesora Bullard de Genética y Neurociencia en elBlavatnik Institute en HMS, y Brian Beliveau, Ph.D., ex becario postdoctoral Damon Runyon en el grupo de Yin y ahora profesor asistente en el Departamento de Ciencias del Genoma de la Universidad de Washington en Seattle.
Yin también es codirector de la Iniciativa de Robótica Molecular del Instituto Wyss y profesor de Biología de Sistemas en la Escuela de Medicina de Harvard; y Cepko también es Investigadora del Instituto Médico Howard Hughes y miembro del Instituto de Células Madre de Harvard.
En SABRE, los investigadores primero programaron el método de "Reacción de intercambio de cebadores" PER del que informó anteriormente el grupo de Yin para sintetizar un concatémero más largo de secuencias idénticas más cortas con la ayuda de una estructura de horquilla de ADN auto-plegable catalítica. Este mecanismo de ingeniería compartesimilitud con el mecanismo enzimático natural que extiende los "telómeros" en los extremos de los cromosomas con repeticiones de ADN idénticas para protegerlos de la degradación, pero se puede ejecutar en un tubo de ensayo.
Los concatémeros generados por PER se hibridan luego a través de secuencias de mango complementarias cortas con sus secuencias de ADN o ARN diana en células y tejidos fijados donde proporcionan un andamio con múltiples sitios de unión para oligonucleótidos fluorescentes cortos 'generadores de imágenes' que se agregan a continuación ".A diferencia del análisis FISH convencional, SABRE nos permite no solo unir una, sino muchas moléculas de colorante fluorescente a un solo objetivo de ácido nucleico, lo que puede aumentar considerablemente la fuerza de la señal que proviene de su ubicación dentro de la célula, y podemos amplificarla aún más.mediante la creación de estructuras ramificadas en pasos de hibridación adicionales, con concatémeros adicionales crecidos a partir de puntos de ramificación internos de concatémeros ya existentes ", dijo Jocelyn Kishi, Ph.D., co-primera autora del estudio y becaria postdoctoral que trabaja con Yin y que desarrolló SABRE conBeliveau. "Esto abre una gran cantidad de nuevas oportunidades".
"SABRE nos permite sintonizar la intensidad de la señal con la abundancia y las localizaciones de objetivos específicos de ARN y ADN en el análisis FISH y, dado que los concatémeros para múltiples objetivos se pueden sintetizar a granel antes de tiempo, SABRE nos proporciona conjuntos de sondas estandarizadas quese pueden generar y reutilizar fácilmente en diferentes estudios ", dijo Beliveau." Además, al lavar repetidamente los generadores de imágenes complementarios a un conjunto de objetivos de una muestra y sustituirlos por generadores de imágenes que se unen a otros objetivos en un proceso que llamamos ADN-Exchange, pudimos multiplexar aún más nuestro enfoque ".
Las características espectrales de los tintes fluorescentes distinguibles permiten a los investigadores analizar solo hasta cuatro objetivos al mismo tiempo mediante microscopía de fluorescencia convencional. Con DNA-Exchange, un conjunto de generadores de imágenes puede eliminarse por lavado de una muestra y reemplazarse por uno diferente.a concatémeros generados por PER en diferentes sitios de destino, y el proceso se puede repetir varias veces. Utilizando el potencial de multiplexación de "Exchange-SABRE", el equipo visualizó 17 regiones distintas del cromosoma X humano de una sola vez utilizando el mismo tipo deequipo microscópico.
Al aplicar SABRE a tejidos gruesos, el grupo de Constance Cepko en HMS demostró el rendimiento y la utilidad del método en la retina, que está organizada en capas con una gran diversidad de tipos de células neurales. "Anteriormente aplicamos la secuenciación unicelular a la retina disociadatejido, pero no pudieron usar los marcadores resultantes para identificar muchos tipos de células simultáneamente en tejido intacto ", dijo el coautor principal Sylvain Lapan, Ph.D., becario postdoctoral en el grupo de Cepko." Al proporcionar detección multiplexada de transcripciones de marcadores,SABRE nos permite cerrar este ciclo y agregar una dimensión espacial a nuestros análisis ".
La clave para su análisis fue un método desarrollado para el estudio de la coautora Emma West que, basado en tinciones de fluorescencia de la superficie celular, puede mapear computacionalmente todas las células contenidas en una sección transversal de la retina en posiciones específicas.equipo para asignar señales individuales obtenidas por análisis FISH mejorado con SABRE a espacios 3D exactos ocupados por células. "Al modelar coordenadas celulares y posiciones de transcripción, podemos crear una representación digital de nuestro tejido que es cuantitativa a nivel de una sola célula. Esto no essolo es útil para identificar tipos de células, pero también para analizar fenotipos y la actividad de elementos genéticos introducidos ", dijo la coautora principal Emma West, quien es estudiante de posgrado en el grupo de Cepko.
Además, el equipo utilizó SABRE-FISH como una herramienta eficaz para identificar elementos genómicos conocidos como potenciadores que impulsan la expresión génica en tipos específicos de células de la retina ". Introdujimos construcciones de ADN recombinante en la retina en las que esos elementos se acoplaban individualmente a unreportero, y al realizar el análisis SABRE-FISH para cuantificar el número de copias de las construcciones en células individuales, así como la expresión del reportero, pudimos correlacionar la actividad de un potenciador específico con la expresión específica del tipo celular ", dijo Lapan.
"La sensibilidad y el flujo de trabajo más simple y económico de SABRE-FISH nos permite recopilar mucha más información de experimentos en los que manipulamos la retina para comprender las redes reguladoras que rigen su desarrollo y evaluar la eficacia de nuestra terapia génicaenfoques para las enfermedades oculares ", dijo Cepko." Es importante destacar que este enfoque tiene el potencial de mejorar de manera similar la investigación en muchos otros tipos de tejidos y órganos ".
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica en Harvard . Original escrito por Benjamin Boettner. Nota: el contenido se puede editar por estilo y longitud.
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