Al abordar uno de los desafíos clave que enfrenta la genética humana actual, un par de equipos de investigación multiinstitucionales han demostrado una herramienta que debería ayudar a desenredar qué variantes genéticas realmente crean riesgo de enfermedad cardíaca, diabetes y una serie de otras enfermedades.
La investigación, realizada por científicos del Broad Institute of MIT y Harvard, la Universidad de Harvard y el Centro de Trastornos de la Sangre y el Cáncer Infantil Dana-Farber / Boston, y presentada en dos artículos publicados el 2 de junio en Celda - emplea una técnica experimental llamada "ensayo de reportero masivamente paralelo". La técnica permite a los investigadores probar miles de variaciones de ADN para identificar las que afectan la regulación génica: cómo se activan y desactivan los genes.
El problema que enfrentan los genetistas con las variantes que causan enfermedades es el exceso de candidatos. Durante la última década, los investigadores de todo el mundo han identificado numerosos tramos de ADN humano asociados con el riesgo de una amplia gama de enfermedades, así como con otros rasgos físicos importantes,en un enfoque conocido como estudios de asociación del genoma completo GWAS. El problema es que cada región puede albergar cientos de variantes genéticas, y es muy difícil saber cuál realmente hace que las personas sean más propensas a enfermarse.
"Con GWAS, obtienes un conjunto de señales que pueden decirte qué regiones del genoma están asociadas con una enfermedad o rasgo particular", dijo Vijay Sankaran, miembro asociado del Broad Institute, hematólogo / oncólogo pediátrico de Dana-Farber / Boston Children's, y autor principal en uno de los dos Celda documentos. "Pero es difícil saber qué golpes son causales, y cuáles simplemente van por el camino".
La imagen se vuelve particularmente complicada cuando se habla de variantes en el ADN no codificante, incluidos los vastos tramos de secuencias que contienen ADN que controlan la expresión génica. Según algunas estimaciones, entre el 85 y el 90 por ciento de las variantes recogidas por GWAS se encuentran en esas regionesPor lo tanto, los científicos están buscando formas de conectar los puntos entre las variantes de GWAS no codificantes, la biología humana y, en última instancia, la enfermedad humana.
"Queremos pasar de la comprensión de los componentes del genoma a la comprensión de los cambios en esos componentes", dijo Pardis Sabeti, miembro del instituto del Instituto Broad, genetista computacional de Harvard y biólogo evolutivo, y autor principal del segundoestudio, cuyo laboratorio prueba el papel que juega la variación genética, en gran medida, juega en la evolución humana y microbiana. "Necesitamos tecnología muy sensible para poder identificar estos cambios funcionales, particularmente si son sutiles".
yendo masivo
Los ensayos de reportero, un elemento básico del kit de herramientas de genómica durante décadas, ayudan a los científicos a examinar los datos de GWAS para encontrar variantes que realmente afecten la expresión o función de los genes. Un investigador toma un fragmento de ADN de lo que puede ser un potenciador, lo combina dentro de un plásmido paraun gen "reportero" que proporciona una lectura p. ej., el gen de la luciferasa e inserta el plásmido en las células. Si la lectura se materializa p. ej., si las células brillan, la secuencia potenciadora impulsó la expresión del reportero. Al ejecutar el ensayocon diferentes variaciones del mismo fragmento, puede surgir un patrón que sugiera si ciertas variantes afectan la expresión.
Sin embargo, tales ensayos tienen una desventaja importante: no se escalan al nivel necesario para investigar las miles a decenas de miles de variantes que podrían aparecer en un GWAS.
Alumbre Broad, Tarjei Mikkelsen ahora con la compañía de biotecnología 10X Genomics, y el científico investigador de Broad, Alexandre Melnikov, elaboró los principios de un sabor de MPRA mientras trabajaba en el laboratorio del director y presidente fundador de Broad, Eric Lander. En 2012, Nature BiotechnologyEn el documento, señalaron que etiquetar cada plásmido con un código de barras de ADN corto y único proporcionaba una segunda lectura. Al secuenciar y contar los ARNm producidos a partir de cada plásmido, podían identificar fácilmente las variantes con mayor influencia en la expresión génica y cuantificarmagnitud de esa influencia.
Y debido a que cada código de barras era único para cada plásmido, el equipo de Mikkelsen y Melnikov podía agrupar y analizar miles de variantes simultáneamente.
Dirigiéndose a los rasgos de las células sanguíneas
El laboratorio de Sankaran usó el sistema MPRA de Mikkelsen y Melnikov para examinar más de 2.750 variantes no codificantes en 75 aciertos de GWAS vinculados a rasgos de glóbulos rojos. Y como él, Mikkelsen y los coprimeros autores, Jacob Ulirsch y Satish Nandakumar, informaron en su Celda en papel, los datos de MPRA descubrieron 32 aciertos que realmente impactaron en la expresión génica. Utilizando ensayos computacionales y funcionales adicionales para investigar más a fondo los efectos de un subconjunto de estas variantes en los rasgos de los glóbulos rojos, el equipo descubrió que varios genes conocidos pueden tener hasta ahoraroles no reconocidos en el desarrollo de células sanguíneas.
"Una de las lecciones inesperadas que aprendimos fue que muchas de las variantes modificaron un regulador principal de desarrollo de la sangre, GATA1", dijo Ulirsch, un científico del personal del laboratorio de Sankaran. "Hubo un patrón común. Ir uno por uno, variante porvariante, nunca hubiéramos podido ver esto "
Edificio MPRA 2.0
Si bien el método original de Mikkelsen y Melnikov es bastante poderoso, el laboratorio de Sabeti quería ver si podían hacerlo aún más robusto.
"La versión original de MPRA está limitada en cuántas variantes puede probar", dijo Ryan Tewhey, becario postdoctoral en el laboratorio de Sabeti y primer autor en el segundo Celda papel. "Queríamos saber, ¿puede expandir esta tecnología? ¿Puede probar decenas de miles de variantes a la vez? ¿Y puede hacerla más sensible?"
Tewhey, Sabeti y su equipo duplicaron la longitud de cada código de barras de ADN y aumentaron el número de códigos de barras hasta 350 por variante. Luego utilizaron su ensayo mejorado para estudiar más de 32,000 posibles variantes reguladoras de células B identificadas por 1000Genomes Project, que caracteriza profundamente a uno asociado con el riesgo de espondilitis anquilosante una enfermedad autoinmune. También destacaron otras 842 variantes candidatas, incluidas 53 particularmente prometedoras asociadas con rasgos y enfermedades humanas.
Como discutieron en su Celda papel, los códigos de barras agregados redujeron el ruido en sus datos y aumentaron la sensibilidad general del ensayo.
"Con más códigos de barras puede comenzar a detectar cambios más sutiles en la expresión, incluidos los cambios que pueden surgir de las diferencias entre los alelos", agregó Tewhey.
Otra vista de la regulación
MPRA no es el único enfoque para extraer agujas causales de los pajares de GWAS, y Tewhey es realista de que no será una panacea para estudiar todos los mecanismos de la célula para regular la expresión.
"Para los promotores y potenciadores, sabemos que funciona bien", dijo. "Para las cosas relacionadas con la conectividad a larga distancia o la forma del genoma, no tenemos tanta confianza".
Sankaran señala que MPRA realmente brilla en su capacidad para encontrar temas en la variación genética que los investigadores pueden combinar con otros datos genéticos, estructurales o funcionales.
"Cuando comienzas a juntar todas estas piezas independientes, obtienes una buena visión de lo que es importante", dijo.
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Materiales proporcionados por Instituto Amplio del MIT y Harvard . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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