Los científicos del Instituto de Enfermedades Infecciosas de la Universidad de Berna han desarrollado un bioensayo in vitro basado en células madre cultivado en matrices de múltiples electrodos capaces de detectar la actividad biológica de las neurotoxinas de Clostridium botulinum. Su ensayo podría servir para minimizar también los experimentos con animales.como proporcionar una plataforma fisiológicamente relevante para la detección de fármacos de compuestos neuroactivos.
Las neurotoxinas de Clostridium botulinum BoNT, producidas por la bacteria Gram-positiva Clostridium botulinum, son las toxinas proteicas de origen natural más venenosas conocidas hasta la fecha. Sin embargo, cuando se aplica en pequeñas cantidades, la toxina causa una parálisis localmente limitada,que es beneficioso en el tratamiento de diversas enfermedades, como diferentes formas de distonía, hiperhidrosis, estrabismo, dolor crónico y dolores de cabeza. Actualmente, se usa más ampliamente en el tratamiento estético para suavizar arrugas y líneas de expresión, una aplicación que se ha vistoun enorme aumento en el uso en las últimas décadas.
Estas toxinas son productos naturales y producidos por bacterias, por lo tanto, se producen variaciones farmacéuticas entre lotes en la concentración y la actividad. Sin embargo, dado que las toxinas, por ejemplo Botox®, están aprobadas por las autoridades reguladoras nacionales como productos farmacéuticos, la seguridad para los pacientes tienepara garantizarse mediante pruebas por lotes del producto final. Actualmente, la potencia de BoNT biológicamente activa se controla mediante ratones intoxicantes en el denominado biosensayo de ratón MBA que se introdujo en la década de 1920. En este ensayo, diferentes diluciones de preparaciones que contienen BoNTse inyectan en ratones y se observan síntomas de parálisis durante varias horas hasta días.
Debido a la enorme demanda de productos farmacéuticos que contienen BoNT, se estima que en los EE. UU. Y Europa, se sacrifican anualmente más de 600,000 ratones para estas pruebas por lotes. Esta gran cantidad de animales y sufrimiento causa preocupaciones éticas considerables. Por lo tanto, existees una gran demanda para el reemplazo del MBA.
En respuesta a esta gran demanda, Stephen Jenkinson, estudiante de doctorado en el laboratorio del Prof. Dr. med. Stephen Leib del Instituto de Infecciosos, ha desarrollado un novedoso ensayo in vitro como alternativa al MBA in vivo ampliamente utilizado.Enfermedades en colaboración con el Departamento de Fisiología, tanto en la Universidad de Berna como con el Laboratorio Spiez, Oficina Federal Suiza para la Protección Civil.
Crecimiento de nuevas neuronas
En el estudio, los investigadores demostraron que las neuronas diferenciadas in vitro de las células madre embrionarias de ratón cultivadas en conjuntos de electrodos múltiples MEA pueden servir como un método basado en células fisiológicamente relevante para detectar holotoxinas y complejos de BoNT / A. Los cultivos neuronales se formaronredes funcionales compuestas de una mezcla heterogénea de neuronas excitadoras e inhibidoras y tras un tratamiento de 24 horas con ~ 1 pM de BoNT / A holotoxina o Botox® se observó un silenciamiento completo de la transmisión sináptica.
"La detección y cuantificación de BoNT en preparaciones farmacéuticas es extremadamente difícil debido a un mecanismo de múltiples pasos de intoxicación celular y la alta potencia de las toxinas", dice Stephen Jenkinson, primer autor del estudio. Hasta la fecha, los métodos basados en células neuronales sonLa única alternativa in vitro al MBA y varios ensayos se han desarrollado utilizando neuronas derivadas de células madre primarias o embrionarias que muestran una sensibilidad similar o incluso mayor que el MBA. Sin embargo, la mayoría de estos ensayos se basan en la homogeneización destructiva del tejido para permitir la cuantificación de BoNT ypor lo tanto, la evaluación requiere métodos adicionales y más tiempo práctico para obtener un resultado. "Además, estos métodos no permiten un monitoreo continuo de la actividad neuronal durante el tratamiento con BoNT", agrega Stephen Leib.
La principal ventaja de este ensayo es el uso de neuronas derivadas de células madre, lo que hace que el uso de animales sea obsoleto. Además, las técnicas de registro MEA permiten un monitoreo continuo no invasivo de la actividad neuronal y este enfoque puede ampliarse fácilmentepara cumplir con los requisitos para una detección prospectiva de alto rendimiento de compuestos neuroactivos. "Además, el uso de sistemas MEA disponibles comercialmente no requiere personal altamente capacitado", dice Jenkinson.
Aunque el ensayo presentado tiene una alta sensibilidad de hasta 1 pM de BoNT / A, se deben realizar más investigaciones para aumentar la sensibilidad general. Sin embargo, Stephen Jenkinson y Stephen Leib creen que el nuevo bioensayo tiene un gran potencial para reducir el uso en animalespara la detección de BoNT y la determinación de la actividad en productos farmacéuticos. Además, el ensayo se puede ampliar para la detección de fármacos de posibles compuestos neuroactivos con énfasis en la actividad sináptica. El estudio ahora se ha publicado en Fronteras en farmacología .
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Materiales proporcionado por Universidad de Berna . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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