Los ARN de transferencia ARNt entregan aminoácidos específicos a los ribosomas durante la traducción del ARN mensajero en proteínas. Por lo tanto, la abundancia de ARNt puede tener un impacto profundo en la fisiología celular, pero la medición de la cantidad de cada ARNt en las células se ha visto limitada por desafíos técnicosLos investigadores del Instituto de Bioquímica Max Planck han superado estas limitaciones con mim-tRNAseq, un método que se puede utilizar para cuantificar los tRNA en cualquier organismo y ayudará a mejorar nuestra comprensión de la regulación del tRNA en la salud y la enfermedad.
Una célula contiene varios cientos de miles de moléculas de ARNt, cada una de las cuales consta de solo 70 a 90 nucleótidos doblados en un patrón similar a una hoja de trébol. En un extremo, los ARNt llevan uno de los veinte aminoácidos que sirven como bloques de construcción de proteínas, mientras quepares de extremos opuestos con el codón que especifica este aminoácido en el ARN mensajero durante la traducción. Aunque solo hay 61 codones para los veinte aminoácidos, las células de diferentes organismos pueden contener cientos de moléculas de ARNt únicas, algunas de las cuales se diferencian entre sí por solo unnucleótido único. Muchos nucleótidos en los ARNt también están decorados con modificaciones químicas, que ayudan a los ARNt a plegarse o unirse al codón correcto.
Los niveles de ARNt individuales se regulan dinámicamente en diferentes tejidos y durante el desarrollo, y los defectos de ARNt están relacionados con enfermedades neurogicas y cáncer. Los orígenes moleculares de estos enlaces siguen sin estar claros, porque la cuantificación de la abundancia y modificaciones de ARNt en las células se ha mantenido durante mucho tiempo.El equipo de Danny Nedialkova del MPI of Biochemistry ha desarrollado mim-tRNAseq, un método que mide con precisión la abundancia y el estado de modificación de diferentes tRNA en las células.
Modificaciones de obstáculos y resoluciones
Para medir los niveles de múltiples ARN simultáneamente, los científicos usan una enzima llamada transcriptasa inversa para primero reescribir el ARN en ADN. Millones de estas copias de ADN se pueden cuantificar en paralelo mediante secuenciación de alto rendimiento. Reescribir ARNt en ADN ha sido tremendamente difícilya que muchas modificaciones del ARNt bloquean la transcriptasa inversa, lo que hace que deje de sintetizar ADN.
"Muchas investigaciones han propuesto soluciones elegantes a este problema, pero todas alivian solo una fracción de los obstáculos de modificación en los ARNt", explica Danny Nedialkova, líder del grupo de investigación Max Planck en el Instituto de Bioquímica Max Planck. "Nos dimos cuenta de queuna transcriptasa inversa específica parecía ser mucho mejor para leer a través de sitios de ARNt modificados. Al optimizar las condiciones de reacción, pudimos mejorar significativamente la eficiencia de la enzima, permitiéndole leer casi todos los obstáculos de modificación de ARNt ", agrega Nedialkova. Esto hizo posibleconstruya bibliotecas de ADN a partir de copias de ARNt de longitud completa y utilícelas para la secuenciación de alto rendimiento.
El kit de herramientas computacionales mim-tRNAseq
El análisis de los datos de secuenciación resultantes también presentó desafíos importantes. "Identificamos dos problemas principales: el primero es la gran similitud de secuencia entre diferentes transcripciones de tRNA", explica Andrew Behrens, estudiante de doctorado en el grupo de Nedialkova y primer autor del artículo.. "El segundo proviene del hecho de que se introduce un nucleótido incorrecto una incorporación errónea en muchos sitios modificados durante la transcripción inversa. Ambos hacen que sea extremadamente difícil asignar cada lectura de ADN a la molécula de ARNt de la que se originó", agrega Behrens.
El equipo abordó estos problemas con enfoques computacionales novedosos, incluido el uso de anotaciones de modificación para orientar la alineación de lectura precisa. El conjunto de herramientas integral resultante se empaqueta en una tubería disponible de forma gratuita para la alineación, el análisis y la visualización de datos de secuenciación derivados del ARNt. Los investigadores puedenuse mim-tRNAseq no solo para medir la abundancia de tRNA, sino también para mapear y cuantificar modificaciones de tRNA que inducen incorporaciones erróneas de nucleótidos por la transcriptasa inversa. "mim-tRNAseq abre innumerables posibilidades de avanzar", dice Nedialkova.y otros para abordar muchas cuestiones pendientes sobre la biología del ARNt en la salud y la enfermedad ".
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Materiales proporcionado por Max-Planck-Gesellschaft . Nota: el contenido se puede editar por estilo y longitud.
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