Para comprender mejor cómo los tejidos y órganos se desarrollan, no funcionan y se regeneran con el tiempo, los investigadores quisieran visualizar los repertorios de moléculas de sus células constituyentes dentro del espacio 3D. Esfuerzos ambiciosos como el "Programa Atlas BioMolecular Humano", elCell Atlas Project "y varios proyectos de atlas cerebrales están en marcha para mapear la presencia y abundancia de muchas proteínas, los productos de la expresión genética, en órganos y tejidos del cuerpo humano a escala de células individuales. Sin embargo, los métodos de imágenes existentessuelen estar limitadas en varios aspectos de su desempeño, su accesibilidad a los investigadores o ambos.
como se informa en Biotecnología de la naturaleza , un equipo dirigido por Peng Yin, Ph.D., en el Instituto Wyss de Ingeniería Biológica de Harvard y la Escuela de Medicina de Harvard HMS ahora ha llenado este vacío con un nuevo enfoque basado en nanotecnología de ADN llamado Immuno-SABRE, abreviatura de"Inmunotinción con amplificación de señal por reacción de intercambio". El método combina la especificidad de dirección de proteínas de anticuerpos comúnmente disponibles con una estrategia de amplificación de señal basada en ADN que permite la visualización altamente multiplexada de muchas proteínas en la misma muestra con fluorescencia preprogramable y sintonizable.señales en cada sitio objetivo. El equipo ha validado su método en una amplia gama de preparaciones de células y tejidos.
"Demostramos que Immuno-SABRE proporciona la capacidad de ajustar de forma independiente la intensidad de la señal para objetivos de proteínas individuales de 5 a 180 veces, con capacidad de multiplexación para permitir la detección simultánea de muchas proteínas. Junto con su velocidad, relativa facilidad de uso yCon bajos costos, esta técnica tiene el potencial de acelerar los estudios de mapeo de proteínas a gran escala y los esfuerzos de descubrimiento de biomarcadores en muchos tejidos y enfermedades ", dijo Peng Yin, miembro del cuerpo docente principal del Wyss Institute.
Sobre la base de los avances de su grupo en el aprovechamiento de las tecnologías de amplificación de señales y códigos de barras impulsadas por la nanotecnología del ADN, Yin también fue recientemente seleccionado como galardonado del Programa Atlas BioMolecular Humano HuBMAP y galardonado del Proyecto Atlas de Células Humanas.co-líder de la Iniciativa de Robótica Molecular del Instituto Wyss y profesor de Biología de Sistemas en HMS.
Los anticuerpos son los reactivos de detección más comunes para proteínas tanto en la investigación como en entornos clínicos. Por lo general, se etiquetan con tinciones fluorescentes para que sean detectables por microscopía. Sin embargo, los métodos de tinción de anticuerpos convencionales generalmente solo permiten el uso de un máximo de cinco tinciones diferentessimultáneamente, y las proteínas diana pueden diferir significativamente en su abundancia, lo que dificulta distinguir las proteínas diana raras con alta sensibilidad de la fluorescencia de fondo que muestran muchos tejidos.
Immuno-SABRE utiliza el método de "reacción de intercambio de cebadores" PER del que informó anteriormente el grupo de Yin para sintetizar concatémeros largos de secuencias de cebadores de ADN cortos con la ayuda de una estructura de horquilla de ADN catalítica. Los concatémeros generados por PER se unen mediante un mango cortosecuencias a códigos de barras de ADN en anticuerpos que se unen a proteínas diana en muestras de tejido y células fijadas con alta especificidad. En el sitio diana, los concatémeros SABER proporcionan un andamio con múltiples sitios de unión para oligonucleótidos fluorescentes complementarios "generadores de imágenes" y, por lo tanto, un mediopara amplificar la señal que emana de cada proteína objetivo.
"Al codificar los anticuerpos con secuencias de ADN cortas únicas y aplicar Immuno-SABRE, podemos visualizar simultáneamente múltiples dianas proteicas en la misma muestra y con alta especificidad. Esto esencialmente abre una manera de analizar la variedad de proteínas presentes en los tejidos de una manera robustay moda multiplexada ", dijo el co-primer y co-autor correspondiente Sinem Saka, Ph.D., quien trabaja como becario postdoctoral en el equipo de Yin.
El equipo aumentó significativamente el potencial de multiplexación de su enfoque Immuno-SABRE al acoplarlo con su técnica de "intercambio de ADN" desarrollada previamente. En el intercambio de ADN, los generadores de imágenes que marcan un conjunto de proteínas objetivo se lavan y se reemplazan por otro conjuntode generadores de imágenes que marcan un grupo diferente de proteínas objetivo y esto se puede repetir varias veces.
Los métodos desarrollados previamente para la detección de proteínas altamente multiplexados que funcionan repitiendo algunos de sus pasos clave en diferentes objetivos de proteínas tienden a sufrir sensibilidades subóptimas, o requieren un tiempo considerable bajo rendimiento y delicadeza para ejecutar. "Exchange-SABRE" proporciona una altasensibilidad con un solo paso de tinción y amplificación, y alta multiplexación y rendimiento con múltiples pasos de intercambio rápido de imágenes ", dijo el co-primer autor Yu Wang, quien es un estudiante graduado en el equipo de Yin." Como prueba de concepto, visualizamos10 proteínas diferentes en criosecciones de la retina del ratón ".
Wang fue co-mentor del coautor George Church, Ph.D., quien es miembro de la Facultad Central en el Instituto Wyss y profesor de Genética en HMS y de Ciencias y Tecnología de la Salud en la Universidad de Harvard y el Instituto de Tecnología de MassachusettsMIT.
Otra faceta clave de Immuno-SABRE que facilita la detección paralela de muchas proteínas a la vez es su capacidad para sintonizar la intensidad de la señal. El equipo lo logró mediante el ensamblaje de estructuras ramificadas más complejas a partir de concatémeros generados por PER que contienen un mayor número de sitios de unión parageneradores de imágenes fluorescentes ". Programar la complejidad de las estructuras de concatémeros basadas en PER nos permite sintonizar la intensidad de la señal con la abundancia de proteínas particulares. Al mismo tiempo, podemos visualizar proteínas raras con productos SABRE ramificados que permiten una mayor amplificación de la señal y abundantes proteínas conproductos SABRE lineales ", dijo Saka. En su estudio, el equipo combinó concatémeros SABRE lineales y ramificados para, por ejemplo, visualizar simultáneamente seis objetivos de proteínas con diferentes abundancias y ubicaciones celulares en muestras de amígdalas humanas.
El conjunto existente del equipo de Yin de tecnologías de imágenes impulsadas por nanotecnología de ADN, incluidas DNA-PAINT y Discrete Molecular Imaging, ha avanzado en el campo de la microscopía de súper resolución, que permite a los investigadores estudiar moléculas individuales en sus ubicaciones normales. Para lograr una resolución igualmente alta deproteínas en entornos de tejidos más complejos, el equipo combinó Immuno-SABRE con un método conocido como "Microscopía de expansión", que fue desarrollado previamente por el coautor Edward Boyden, Ph.D., el profesor de neurotecnología Y. Eva Tan en el MIT.El método de expansión hincha los tejidos fijados artificialmente a volúmenes más grandes, lo que aumenta la distancia de separación entre las moléculas individuales y, por lo tanto, mejora su resolución efectiva sin la necesidad de instrumentos especializados ". La combinación de microscopía de expansión con Exchange-SABRE simultáneamente nos brinda un alto rendimiento de multiplexación,y -capacidades de resolución necesarias para impulsar esfuerzos como la construcción de atlas moleculares para el cuerpo humanohacia adelante de manera más efectiva ", dijo Wang.
"El equipo de Peng Yin vuelve a demostrar cómo pueden programar moléculas de ADN diseñadas para llevar a cabo tareas específicas como robots moleculares, en este caso permitiéndonos visualizar simultáneamente la ubicación de numerosas proteínas dentro de las células y tejidos humanos con alta resolución, lo que debería acelerar enormementedescubrimiento de mecanismos moleculares de control biológico, así como de nuevos biomarcadores de enfermedades ", dijo el director fundador del Instituto Wyss, Donald Ingber, MD, Ph.D., quien también es profesor de Biología Vascular Judah Folkman en HMS, el Programa de Biología Vascular del Boston Children'sHospital, y profesor de bioingeniería en la Escuela de Ingeniería y Ciencias Aplicadas SEAS John A. Paulson de Harvard.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica en Harvard . Original escrito por Benjamin Boettner. Nota: el contenido se puede editar por estilo y longitud.
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