Los genetistas han estado utilizando organismos modelo que van desde el ratón doméstico hasta la levadura de panadería unicelular, Saccharomyces cerevisiae, para estudiar procesos biológicos básicos que regulan el desarrollo humano y la fisiología, y que pueden verse comprometidos en diversas enfermedades. Esto ha sido posibleporque muchos de los genes que controlan estos procesos en humanos también están presentes con funciones similares en esas otras especies, y porque los genes en los organismos modelo pueden mutarse y eliminarse en el laboratorio a voluntad. Sin embargo, hasta ahora, incluso enAl manipular la levadura, los genes tuvieron que ser eliminados de un gen a la vez, a menudo dejando modificaciones de secuencia no deseadas adicionales en su genoma.
Un equipo en el Instituto Wyss de Harvard dirigido por su miembro de la Facultad Core, George Church, ahora presenta una estrategia basada en CRISPR-Cas9 en Biotecnología de la naturaleza que resuelve ambos problemas. Utilizando la levadura de panadería, los investigadores desarrollaron un enfoque de alto rendimiento que permite a los investigadores alterar con precisión cientos de genes o características diferentes de un solo gen a la vez en células de levadura individuales con una eficiencia del 80 al 100%,seleccione células de la población que muestren comportamientos específicos e identifique las alteraciones genéticas que las desencadenan o evitan.
"Nuestro método no solo ofrece una forma más eficiente y precisa de realizar" genómica funcional "de alto rendimiento en levadura que lo que era posible con métodos anteriores. También nos permitirá modelar y probar variaciones sutiles de genes humanos en células de levadura quese ha asociado libremente con ciertos rasgos o trastornos, y descubra cuáles pueden ser realmente relevantes ", dijo Church, Ph.D., quien también es profesor de Genética en la Facultad de Medicina de Harvard HMS y de Ciencias y Tecnología de la Salud en Harvard.y el Instituto de Tecnología de Massachusetts MIT.
Las variaciones en los genes humanos normalmente no se producen como deleciones perfectas de sus secuencias del genoma, sino que consisten en pequeñas mutaciones puntuales: sustituciones de unidades de base A, T, C o G individuales en el código de ADN para una de lasotros, o la inserción o eliminación de unas pocas unidades base. Para recrear tales variaciones en el genoma de la levadura en ausencia de otras variaciones potencialmente interferentes, el equipo aprovechó CRISPR-Cas9, que puede ser dirigido con precisión a secuencias preseleccionadas enel ADN con la ayuda de un pequeño ARN guía ARNg. Después de que la enzima Cas9 ha cortado su secuencia objetivo, un proceso conocido como recombinación dirigida por homología HDR puede reparar el gen mediante el uso de información de una secuencia de plantilla de donante adicional queconlleva una variación de interés.
"Hemos desarrollado una estrategia que une físicamente los planos para el sgRNA y la plantilla del donante en una molécula de ADN extracromosómica estable y heredable guía + donante. Esto nos permitió construir grandes bibliotecas de variantes en una reacción, entregar múltiples correspondientesLos sgRNA y las plantillas de donantes en masa a las células de levadura e identifican aquellos que estimulan un cierto comportamiento celular mediante la secuenciación de la próxima generación ", dijo el becario postdoctoral Xiaoge Guo, Ph.D., uno de los primeros autores del estudio.
En estudios de prueba de concepto, el equipo primero se enfocó en un solo gen altamente conservado que codifica la helicasa de ADN y la enzima de reparación SGS1. Luego, dañaron ampliamente el ADN de la población de células de levadura que portaba la biblioteca guía + donante con un reactivo tóxicoy secuenciaron el ADN de las células supervivientes. Esto les permitió descubrir mutaciones que comprometen las características de SGS1 que son vitales para la reparación del ADN dañado y que garantizan la supervivencia continua de las células.
A continuación, el equipo aplicó su estrategia de guía + donante para eliminar a 315 miembros de una familia de genes mal entendida, que codifican los llamados pequeños marcos de lectura abiertos SMORF que se encuentran dispersos por todo el genoma, de una sola vez.esto afecta la supervivencia de las células de levadura en diferentes condiciones de estrés ambiental, podrían asignar funciones esenciales previamente desconocidas a smORF específicos, abriendo así una nueva puerta a su análisis.
"Además de utilizar el método para extraer nuevas funciones de genes y familias de genes más grandes, un potencial intrigante también reside en la investigación de secuencias no codificantes en el genoma para avanzar en nuestra comprensión de la regulación génica y la biología cromosómica", dijo primero yco-autor correspondiente Alejandro Chavez, MD, Ph.D., quien como becario postdoctoral fue co-asesorado por James Collins, miembro de la Facultad Core de la Iglesia y el Instituto Wyss y ahora es profesor asistente en la Universidad de Columbia.
Collins, Ph.D., que colaboró con el equipo en el estudio, también es el Profesor Termeer de Ingeniería Médica y Ciencia en el MIT y Profesor de Ingeniería Biológica en el MIT. "También podemos usar el método de guía + donante paraaplicaciones de biología sintética que tienen como objetivo diseñar células de levadura con habilidades metabólicas e industriales relevantes, o transferirlas a cepas de levadura patológicas para el descubrimiento de genes y funciones genéticas que afectan sus propiedades infecciosas ", dijo.
"Esta nueva aplicación de la tecnología CRISPR-Cas9 que surgió a través de una colaboración dinámica entre los laboratorios Church y Collins abre otro camino hacia el descubrimiento de mecanismos moleculares previamente ocultos por los cuales las células regulan su fisiología y, cuando están desreguladas, conducen a infecciones comoasí como enfermedades humanas ", dijo el Director Fundador del Instituto Wyss, Donald Ingber, MD, Ph.D., quien también es el Profesor Judah Folkman de Biología Vascular en el HMS y el Programa de Biología Vascular en el Boston Children's Hospital, así como el Profesor de Bioingeniería enHarvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Instituto Wyss de Ingeniería Biológicamente Inspirada en Harvard . Original escrito por Benjamin Boettner. Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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