En el campo de rápido crecimiento de la biología sintética, en el que los organismos pueden diseñarse para hacer cosas como descomponer plástico y fabricar biocombustibles y medicamentos, la producción de secuencias de ADN personalizadas es una herramienta fundamental para el descubrimiento científico. Sin embargo, el proceso de síntesis de ADN, queha permanecido prácticamente sin cambios durante más de 40 años, puede ser lento y poco confiable.
Ahora, en lo que podría abordar un cuello de botella crítico en la investigación biológica, los investigadores del Instituto Conjunto de BioEnergía JBEI del Departamento de Energía, con sede en el Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley Berkeley Lab, anunciaron que han sido pioneros en una nueva forma de sintetizar secuencias de ADN a través deun uso creativo de enzimas que promete ser más rápido, más barato y más preciso. El descubrimiento, dirigido por los estudiantes graduados del JBEI Sebastian Palluk y Daniel Arlow, se publicó en Biotecnología de la naturaleza en un artículo titulado "Síntesis de ADN de novo utilizando conjugados polimerasa-nucleótido".
"La síntesis de ADN es el núcleo de todo lo que intentamos hacer cuando construimos biología", dijo el director ejecutivo de JBEI, Jay Keasling, autor correspondiente del artículo y también científico principal de la facultad de Berkeley Lab. "Sebastian y Dan han creado lo que yocreemos que será la mejor manera de sintetizar ADN desde que [Marvin] Caruthers inventó la síntesis de ADN en fase sólida hace casi 40 años. Lo que esto significa para la ciencia es que podemos diseñar la biología de manera mucho menos costosa, y de nuevas formas, de lo que lo haríamos.he podido hacer en el pasado ".
El proceso de Caruthers utiliza las herramientas de la química orgánica para unir los bloques de construcción de ADN de uno en uno y se ha convertido en el método estándar utilizado por las empresas de síntesis de ADN y los laboratorios de todo el mundo. Sin embargo, tiene inconvenientes, el principal es que alcanzasu límite en aproximadamente 200 bases, en parte debido a reacciones secundarias que pueden ocurrir durante el procedimiento de síntesis, y que produce desechos peligrosos. Para los investigadores, incluso 1,000 bases se consideran un gen pequeño, por lo que para hacer secuencias más largas, las más cortas se cosenjuntos utilizando un proceso que es propenso a fallas y no puede realizar ciertas secuencias.
Compre sus genes en línea
Una secuencia de ADN se compone de una combinación de cuatro bases químicas, representadas por las letras A, C, T y G. Los investigadores trabajan regularmente con genes de varios miles de bases de longitud. Para obtenerlos, necesitan aislarlos genes de un organismo existente, o pueden solicitar los genes a una empresa.
"Literalmente pegas la secuencia en un sitio web y luego esperas dos semanas", dijo Arlow. Supongamos que compras 10 genes. Tal vez nueve de ellos te lleguen a tiempo. Además, si quieres probar unmil genes, a $ 300 por gen, los costos se acumulan muy rápidamente ".
Palluk y Arlow estaban motivados para trabajar en este problema porque, como estudiantes, pasaban muchas horas largas y tediosas haciendo secuencias de ADN para sus experimentos cuando preferirían haber estado haciendo el experimento real.
"El ADN es una biomolécula enorme", dijo Palluk. "La naturaleza fabrica biomoléculas utilizando enzimas, y esas enzimas son increíblemente buenas para manipular y copiar ADN. Por lo general, nuestros procesos de química orgánica no están ni cerca de la precisión que ofrecen las enzimas naturales."
Pensando fuera de la caja
La idea de usar una enzima para producir ADN no es nueva; los científicos han estado tratando durante décadas de encontrar una manera de hacerlo, sin éxito. La enzima de elección se llama TdT desoxinucleotidil transferasa terminal, que se encuentra enel sistema inmunológico de los vertebrados y es una de las pocas enzimas en la naturaleza que escribe nuevo ADN desde cero en lugar de copiarlo. Además, es rápido, capaz de agregar 200 bases por minuto.
Para aprovechar la TdT para sintetizar una secuencia deseada, el requisito clave es hacer que agregue solo un nucleótido, o bloque de construcción de ADN, y luego se detenga antes de que siga agregando el mismo nucleótido repetidamente. Todas las propuestas anteriores se imaginaron usando nucleótidosmodificado con grupos de bloqueo especiales para evitar múltiples adiciones. Sin embargo, el problema es que el sitio catalítico de la enzima no es lo suficientemente grande para aceptar el nucleótido con un grupo de bloqueo adjunto. "La gente básicamente ha tratado de 'cavar un agujero' en la enzimaal mutarlo para dejar espacio para este grupo de bloqueo ", dijo Arlow." Es complicado porque necesita hacer espacio para él, pero tampoco arruinar la actividad de la enzima ".
Palluk y Arlow idearon un enfoque diferente. "En lugar de intentar cavar un agujero en la enzima, lo que hacemos es atar un nucleótido a cada enzima TdT a través de un enlazador escindible", dijo Arlow. "De esa manera, después de extenderuna molécula de ADN que usa su nucleótido unido, la enzima no tiene otros nucleótidos disponibles para agregar, por lo que se detiene. Una ventaja clave de este enfoque es que la columna vertebral del ADN, la parte que realmente realiza la reacción química, es comoADN natural, para que podamos tratar de obtener la máxima velocidad de la enzima ".
Una vez que se agrega el nucleótido a la molécula de ADN, la enzima se escinde. Luego, el ciclo puede comenzar de nuevo con el siguiente nucleótido unido a otra enzima TdT.
Keasling considera que el enfoque es inteligente y contrario a la intuición. "En lugar de reutilizar una enzima como catalizador, dijeron: 'Oye, podemos producir enzimas a un precio muy económico. Vamos a tirarlas'. Entonces, la enzima se convierte en un reactivo en lugar de un catalizador.", dijo." Ese tipo de pensamiento les permitió hacer algo muy diferente de lo que se ha propuesto en la literatura y, creo, lograr algo realmente importante ".
Demostraron su método haciendo manualmente una secuencia de ADN de 10 bases. No es sorprendente que los dos estudiantes se encontraran inicialmente con escepticismo. "Incluso cuando teníamos los primeros resultados, la gente decía: 'No tiene sentido, nono parece correcto. No es así como se usa una enzima '", recordó Palluk.
Los dos todavía tienen mucho trabajo por hacer para optimizar su método, pero están razonablemente seguros de que eventualmente podrán hacer un gen con 1,000 bases de una sola vez a muchas veces la velocidad del método químico.
"Después de décadas de optimización y ajuste, el método convencional ahora normalmente alcanza un rendimiento de aproximadamente el 99,5 por ciento por paso. Nuestra síntesis de prueba de concepto tuvo un rendimiento del 98 por ciento por paso, por lo que aún no está a la par, pero es un punto de partida prometedor ", dijo Palluk." Creemos que nos pondremos al día pronto y creemos que podemos llevar el sistema mucho más allá de las limitaciones actuales de la síntesis química ".
"Nuestro sueño es crear un gen de la noche a la mañana", dijo Arlow. "Para las empresas que intentan biofabricar de manera sostenible productos útiles, nuevos fármacos o herramientas para una agricultura más respetuosa con el medio ambiente, y para JBEI y DOE, donde estamos tratando de producircombustibles y productos químicos de la biomasa, la síntesis de ADN es un paso clave. Si lo acelera, podría acelerar drásticamente todo el proceso de descubrimiento ".
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por DOE / Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley . Nota: el contenido se puede editar por estilo y longitud.
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