Cada una de nuestras células tiene los mismos 22.000 genes o más en su genoma, pero cada una usa combinaciones diferentes de esos mismos genes, activándolos y desactivándolos según lo exija su función y situación. Son estos patrones de genes expresados y reprimidos los quedeterminar en qué tipo de célula riñón, cerebro, piel, corazón se convertirá cada una.
Para controlar estos patrones cambiantes, nuestros genomas contienen secuencias reguladoras que activan y desactivan genes en respuesta a señales químicas específicas. Entre estos se encuentran "potenciadores", secuencias que pueden ubicar a decenas de miles de letras genéticas alejadas de un gen, pero aún asíforzarlo a overdrive cuando se activa. Los pasos en falso en esta delicada coreografía pueden llevar a las células a asumir el papel equivocado, causando enfermedades debilitantes, pero las regiones reguladoras involucradas son difíciles de encontrar y estudiar, ya que solo juegan un papel en células específicas, a menudo bajo muycondiciones específicas.
Ahora, un equipo de investigación dirigido por científicos de la Universidad de California ha utilizado una versión modificada de la técnica de edición de genes CRISPR para encontrar potenciadores, no editándolos sino impulsándolos a la acción. Como se informó en línea el 30 de agosto de 2017 en Naturaleza , un equipo de UC San Francisco y la Universidad de California, Berkeley, utilizó una herramienta llamada activación CRISPR CRISPRa, desarrollada en UCSF en 2013, para buscar potenciadores de un gen que afecta el desarrollo de las células inmunes conocidas como TLas secuencias que encontraron iluminan los circuitos fundamentales de trastornos autoinmunes como la enfermedad inflamatoria intestinal EII y la enfermedad de Crohn.
El trabajo se llevó a cabo en los laboratorios de Alexander Marson, MD, PhD, profesor asistente de microbiología e inmunología en UCSF, y Jacob Corn, PhD, profesor adjunto asistente de biología molecular y celular en Berkeley.
"No solo ahora podemos encontrar estas regiones reguladoras, sino que podemos hacerlo tan rápida y fácilmente que es alucinante", dijo Corn. "Habría tomado años encontrar solo una antes, pero ahora se necesita unapersona solo unos meses para encontrar varios. "
Corn es cofundador y director científico del Innovative Genomics Institute IGI, una iniciativa de Berkeley-UCSF de la que Marson es miembro afiliado. El IGI tiene como objetivo promover la edición del genoma basada en CRISPR en medicina y agricultura para curar enfermedades humanas, acabar con el hambre y proteger el medio ambiente.
CRISPRa enciende los potenciadores
La llegada de CRISPR ha permitido a los investigadores hacer un rápido progreso en la comprensión de los genes que codifican proteínas. En la aplicación más común de CRISPR, una enzima llamada Cas9 corta el ADN en secuencias particulares especificadas por la secuencia de un "ARN guía".tecnología, los científicos pueden extirpar o editar cualquier gen y observar cómo estos cambios afectan las células u organismos completos.
Pero las secuencias que codifican directamente proteínas constituyen solo el 2 por ciento de nuestro genoma. Los potenciadores y otros elementos reguladores del ADN diseminados por el otro 98 por ciento son más difíciles de estudiar, pero están implicados en una gran cantidad de trastornos genéticos. Los científicos pueden buscarpara las secuencias potenciadoras potenciales basadas en cómo interactúan con las proteínas que se unen al ADN, pero descubrir qué potenciadores funcionan con qué genes es mucho más complicado. Simplemente eliminar un potenciador con CRISPR-Cas9 no ayuda, porque no tendráun efecto notable si el potenciador está inactivo en el tipo de célula particular utilizado en un experimento.
Si piensa en el genoma como una casa modelo con 22.000 bombillas los genes y cientos de miles de interruptores los potenciadores, los desafíos han sido encontrar todos los interruptores y averiguar qué bombillas controlan y cuándo. Anteriormente, CRISPR se ha utilizado para cortar cables en busca de los que harían que una bombilla se apagara, lo que da una buena idea de lo que estaba haciendo esa sección del circuito. Sin embargo, cortar un interruptor de luz cuando está apagado no te dicecualquier cosa sobre lo que controla. Por lo tanto, para encontrar ciertos interruptores de luz, ha sido común tratar de imitar las complicadas señales químicas que activan un potenciador.
Pero al usar este método, "puede volverse loco rápidamente tratando de encontrar un potenciador", dijo Benjamin Gowen, un becario postdoctoral en el laboratorio de Corn en Berkeley y uno de los autores principales del estudio.
Un mejor enfoque sería un interruptor universal de "encendido" que pudiera apuntar a cualquier parte del genoma y, si esa parte incluyera un potenciador, podría activar ese potenciador. Afortunadamente, CRISPRa, desarrollado recientemente por Jonathan Weissman, PhD, profesor dey farmacología molecular en UCSF y codirector del IGI, es una herramienta de este tipo. CRISPRa utiliza una versión "roma" de la proteína Cas9 que corta el ADN, atada a una cadena de proteínas activadoras. Aunque CRISPRa también usa ARN guía para apuntarubicaciones precisas en el genoma, en lugar de cortar el ADN, CRISPRa puede activar cualquier potenciador en el área.
Si bien las primeras aplicaciones de CRISPRa implicaron el uso de un único ARN guía para encontrar promotores, secuencias junto a los genes que ayudan a activarlos, el equipo de UCSF / Berkeley detrás del nuevo estudio se dio cuenta de que CRISPRa también podría ayudar a encontrar potenciadores.Dirigiendo el complejo CRISPRa a miles de sitios potenciadores potenciales diferentes, razonaron, podrían determinar cuál tenía la capacidad de activar un gen en particular, incluso si ese gen estaba lejos del potenciador en el cromosoma.
"Esta es una forma fundamentalmente diferente de ver las secuencias reguladoras no codificantes", dijo Dimitre Simeonov, estudiante de doctorado en el laboratorio de Marson en la UCSF y otro autor principal del estudio.
Realización de 20.000 experimentos a la vez
El gen que el equipo decidió estudiar produce una proteína llamada IL2RA, que es fundamental para la función de las células inmunitarias llamadas células T. Dependiendo de las condiciones del cuerpo, las células T tienen la capacidad de desencadenar inflamación o suprimirla. IL2RAEl gen produce una proteína que le dice a las células T que es hora de ponerse sus sombreros antiinflamatorios. Si los potenciadores que deberían activar el gen tienen errores, las células no logran suprimir la inflamación, lo que puede conducir a trastornos autoinmunes como la enfermedad de Crohn.
Para rastrear las ubicaciones de los potenciadores que controlan IL2RA, el equipo de UCSF y Berkeley produjeron más de 20.000 ARN guía diferentes y los colocaron en las células T con una proteína Cas9 modificada.
"Básicamente, realizamos 20.000 experimentos en paralelo para encontrar todas las secuencias que activan este gen", dijo Marson.
Efectivamente, apuntar a algunas de las secuencias con CRISPRa aumentó la producción de IL2RA, lo que arrojó una breve lista de ubicaciones que podrían ser importantes para regular el destino de las células T.
"Siempre que tienes la oportunidad de hacer una pregunta de una manera totalmente nueva, de repente puedes descubrir cosas que te habrías perdido con métodos más antiguos", dijo Gowen. "Encontramos estos potenciadores sin tener que suponer lo queparecía."
Vinculación de potenciadores mutantes a enfermedades inflamatorias
Una de las posibles secuencias potenciadoras que identificó el equipo incluía el sitio de una variante genética común que ya se sabía que aumentaba el riesgo de EII, aunque no se entendía cómo lo hacía. Los equipos de Marson y Corn se preguntaron si esta variación genética podría alterarel interruptor que regula la cantidad de proteína IL2RA presente en las células T. Para probar esto, modificaron las células T de ratón para que contuvieran la variante genética asociada con la enfermedad humana, y encontraron que estas células T de hecho producían menos IL2RA.
"Esto comienza a desbloquear los circuitos fundamentales de la regulación de las células inmunitarias, lo que aumentará drásticamente nuestra comprensión de las enfermedades", dijo Marson.
A continuación, el equipo espera expandir el método, quizás encontrando formas de buscar potenciadores de muchos genes diferentes a la vez, haciendo que la búsqueda de reguladores de trastornos inmunitarios sea mucho más rápida. Y esperan que el método sea una herramienta ampliamente aplicable paradesvinculando interacciones genéticas en todo tipo de células.
"Creemos que este será un método muy útil en general", dijo Corn. "Sería fácil para alguien interesado en las neuronas o cualquier otro tipo de célula detectarlo y buscar los potenciadores involucrados en la programación de esas células".comportamiento."
Otros autores del estudio incluyen a Theodore L. Roth, Youjin Lee, John D. Gagnon, Alice Y. Chan, Dmytro S. Lituiev, Michelle L. Nguyen, Rachel E. Gate, Eric Boyer, Frederic Van Gool, Meena Subramaniam, Zhongmei Li, Jonathan M. Woo, Victoria R. Tobin, Kathrin Schumann, K. Mark Ansel, Chun Ye, William J. Greenleaf, Mark S. Anderson y Jeffrey A. Bluestone de UCSF; Mandy Boontanrart, Nicolas L. Bray, Therese Mitros, Graham J. Ray, Gemma L. Curie, Nicki Naddaf, Julia S. Chu y Hong Ma de Berkeley; Maxwell R. Mumbach, Howard Y. Chang y Ansuman T. Satpathy de la Universidad de Stanford; Hailiang Huang,Ruize Liu y Mark J. Daly de la Universidad de Harvard; y Kyle K. Farh de Illumina Inc.
Esta investigación fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones DP3DK111914-01, R01HG0081410-01, R01HL109102, P50-HG007735, S10RR029668, S10RR027303 y P30 DK063720, la Scleroderma Research Foundation, la beca de la UCSF, SandlerJake Aronov, una subvención de la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple CA 1074-A-21, y el Programa Marcus en Innovación en Medicina de Precisión. Marson y Schumann han presentado una patente sobre el uso de proteínas ribonucleares Cas9 para editar el genoma de células hematopoyéticas primarias humanas. Chang y Greenleaf son cofundadores de Epinomics. Marson se desempeña como asesor de Juno Therapeutics y PACT Therapeutics, y el laboratorio de Marson ha recibido apoyo de investigación patrocinado por Juno Therapeutics y Epinomics.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Universidad de California - San Francisco . Original escrito por Pete Farley. Nota: el contenido se puede editar por estilo y longitud.
Referencia de la revista :
cite esta página :