Los investigadores esperan desarrollar vacunas, terapias y nuevas pruebas de diagnóstico para una amplia gama de enfermedades. Para lograr esto, deberán comprender mejor una clase crítica de componentes biológicos. Conocidos como proteínas de membrana superficial, estos ingredientes vitalesEn el proceso de la enfermedad, se forma un conjunto estructural y funcionalmente diverso de enorme complejidad.
En un nuevo estudio, Debra Hansen, profesora de investigación en el Biodesign Institute de la Universidad Estatal de Arizona, explora un medio innovador para investigar las proteínas de membrana producidas por un par de organismos altamente patógenos. El equipo de investigación demostró que la inmunización genética basada en el ADN, utilizando undispositivo conocido como pistola de genes, podría expresar con éxito proteínas de membrana en ratones e inducir a los animales a producir una gama de anticuerpos críticos contra objetivos bacterianos y virales.
"Aprendimos que nuestro nuevo proceso de producción de anticuerpos es increíblemente eficiente. Si la proteína de membrana es naturalmente inmunogénica, generamos fácilmente altos niveles de anticuerpos usando solo los genes", dice Hansen. "En lugar de purificar laboriosamente la proteína de membrana e intentarpara mantener la estructura proteica adecuada dentro de los detergentes antes de la inmunización, dejamos que el huésped inmunizado haga el trabajo por nosotros ".
El nuevo estudio también describe un método para expresar y purificar proteínas de membrana en un tubo de ensayo y examinar sus actividades de unión con anticuerpos específicos en sangre extraída de ratones inmunizados con genes.
Convencionalmente, la producción de una respuesta inmune a una proteína extraña requiere la purificación de la proteína, que luego se inyecta en un animal. El proceso es engorroso, desafiante y requiere mucho tiempo. En el estudio actual, una respuesta inmune se produce introduciendo directamenteUn gen que codifica la proteína de interés.
Dos de las proteínas de membrana producidas en el estudio también se introdujeron con éxito en las membranas de la bacteria E. coli , a través del proceso de ADN recombinante. El uso de los anticuerpos específicos presentes en la sangre de ratones inmunizados con genes demostró por primera vez que ambas proteínas de membrana podían expresarse de forma recombinante en un organismo vivo, plegarse correctamente en estructuras 3-D adecuadas ymigrar a las membranas dentro E. coli . Estos resultados ahora facilitan la determinación estructural de estas dos proteínas de virulencia críticas.
La investigación, que aparece en la edición actual de la revista Nature Publishing Group Informes científicos , promete ofrecer nuevos conocimientos sobre la estructura y función de las proteínas de membrana de importancia crítica para la medicina.
en la superficie
Las proteínas de membrana están implicadas en innumerables funciones en los organismos vivos, incluida la señalización y comunicación celular, la conversión y utilización de energía, el transporte molecular y la catálisis. Debido a su implicación en una variedad de enfermedades, recientemente se han convertido en objetivos principales para una nueva gama de terapias.De hecho, más del 50 por ciento de todos los objetivos terapéuticos son proteínas de membrana. Se espera que el número aumente a medida que se aprenda más sobre la estructura y función de la proteína de membrana.
A pesar de su importante papel como interfaz molecular en las interacciones huésped / patógeno, así como en las relaciones fármaco / célula, las proteínas de membrana representan menos del 1 por ciento de las 100,000 estructuras proteicas únicas actualmente catalogadas. Esto se debe en gran parte a los serios desafíos involucrados enproduciendo, purificando y determinando las estructuras de las proteínas de membrana. Hansen y sus colegas describen nuevas estrategias para producir anticuerpos: proteínas especializadas producidas naturalmente por el sistema inmune en respuesta a patógenos u otros agentes biológicos amenazadores.
En el estudio actual, describen el uso de una pistola de genes para introducir información de ADN en un ratón. El dispositivo portátil utiliza una explosión de gas para impulsar partículas de oro impregnadas con ADN circulares conocidos como plásmidos en la piel de los ratones. El orolas partículas se conocen como micronanoplexes. La tecnología de la pistola genética fue pionera y desarrollada por Stephen A. Johnston, codirector del Centro de Biodiseño para Innovaciones en Medicina.
El material genético introducido a través de la pistola de genes es absorbido por las células dendríticas del ratón y traducido en proteína de membrana en tejidos dérmicos y ganglios linfáticos. El sistema inmunitario del ratón responde produciendo anticuerpos específicos capaces de unirse a las proteínas de la membrana. Mientras que la técnica básicade inmunización genética ha estado en uso durante algún tiempo, el estudio marca la primera descripción de la amplia aplicabilidad de este enfoque a las proteínas de membrana, así como la primera aplicación de micronanoplases de ADN-oro para estimular la producción de anticuerpos.
amenazas bacterianas y virales examinadas
Los resultados mostraron que la inmunización genética produjo con éxito anticuerpos específicos para 12 de las 17 proteínas de membrana de dos patógenos de Nivel de Bioseguridad 3: Francisella tularensis y el virus de la peste porcina africana ASFV. F. tularensis causa la enfermedad tularemia. Es una enfermedad infecciosa ampliamente estudiada.patógeno conocido por su capacidad de invadir numerosos tipos de células y evadir hábilmente el sistema inmune. Es una de las bacterias más patógenas en la tierra, capaz de causar una infección mortal con tan solo 10 células. El virus de la peste porcina africana es portado por artrópodos.La infección en cerdos causa una enfermedad hemorrágica letal e intratable que ha devastado las poblaciones porcinas en áreas de África y Europa del Este.
Las investigaciones de proteínas de enfermedades endógenas producidas por estos organismos son difíciles, ya que requieren instalaciones y protocolos de seguridad especializados debido al peligro potencial que representan para los investigadores. El nuevo método descrito permite la producción de proteínas de membrana de estos patógenos y anticuerpos asociados a través de ADNenfoques, permitiendo el manejo seguro de material biológico sin riesgo de infección.
Una vez que se han producido anticuerpos contra proteínas de membrana específicas en el ratón, el grupo buscó caracterizar la sangre o suero de ratón resultante. Para hacer esto, un nuevo sistema conocido como traducción in vitro en presencia de perlas magnéticas hidrófobas IVT-HMB, aquí se produce una pequeña calidad de proteína de membrana en un tubo de ensayo, que se extrae simultáneamente con perlas hidrófobas y luego se analiza contra los sueros extraídos de ratones inmunizados con genes. Detección de una señal resultante en dos tipos de pruebas o ensayos de diagnóstico.ELISA y Western blot establecieron la presencia en el suero de ratones de anticuerpos específicos para cada proteína de membrana. El método IVT-HMB representa una potente racionalización de la producción de proteínas de membrana, lo que impide el arduo proceso de aislamiento y purificación tradicionalmente requerido.
escalones para estructuras de proteínas
El uso de rayos X para obtener imágenes de pequeños cristales de proteínas es un método poderoso para determinar la estructura detallada de las proteínas, pero la técnica enfrenta muchos desafíos, incluida la dificultad de producir y purificar proteínas que se ensamblan adecuadamente. La investigación actual marca un punto de partida para másCaracterización estructural de proteínas de membrana, utilizando técnicas como la crio-EM y la cristalografía de rayos X.
Petra Fromme, coautora del nuevo estudio y directora del Centro de Descubrimiento Estructural Aplicado del Biodesign Institute, destaca el poder de la nueva investigación: "La gama de anticuerpos producidos a través de técnicas como la inmunización genética abre la puerta a la alta resoluciónlas imágenes moleculares de las proteínas de membrana importantes ", dice ella." Los anticuerpos resultantes ayudan a la determinación estructural en una variedad de formas importantes, identificando proteínas ensambladas adecuadamente, ayudando a inducir a las proteínas a ensamblarse con otras proteínas en cristales bien ordenados y estabilizando o atrapando proteínas en forma activaestados que se pueden capturar con rayos X "
En la siguiente fase de investigación, el grupo planea producir anticuerpos monoclonales usando el mismo proceso de inmunización. Estos son esenciales como factores de unión o ligandos de cocristalización, utilizados para la determinación estructural de proteínas de membrana mediante cristalografía de rayos X. Los autoresAdemás, tenga en cuenta que los anticuerpos monoclonales producidos a través de técnicas de inmunización genética ofrecen candidatos atractivos para futuras terapias contra una amplia gama de enfermedades.
Este estudio fue un esfuerzo combinado de la facultad en el Biodesign Institute, incluyendo a Debra Hansen del Centro de Innovaciones en Medicina CIM, Centro de Descubrimiento Estructural Aplicado CASD y la Facultad de Ciencias Moleculares SMS, Kathryn Sykes deCIM y Petra Fromme de CASD y SMS, junto con sus equipos de investigadores y estudiantes, incluidos los investigadores Mark Robida, Andrey Loskutov y Tien Olson, los investigadores Felicia Craciunescu, John-Charles Rodenberry y Hetal Patel y el estudiante graduado Xiao Wang de CIM ypostdoc Katerina Dörner de SMS.
Todos los clones necesarios ADN plasmídico para aplicar este enfoque están disponibles a través del Repositorio de Plásmidos DNASU, que se encuentra en el Centro de Diagnósticos Personalizados de Biodesign.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Universidad Estatal de Arizona . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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