CRISPR-Cas9 facilita la eliminación o modificación de un solo gen para determinar su efecto en un organismo o célula, o incluso en otro gen. Pero, ¿y si pudiera realizar varios miles de experimentos a la vez, utilizando CRISPR para modificar cada gen enel genoma individual y rápidamente ver el impacto de cada uno?
Un equipo de científicos de la Universidad de California, Berkeley, ha desarrollado una manera fácil de hacer precisamente eso, que permite a cualquiera perfilar una célula, incluidas las células humanas, y determinar rápidamente todas las secuencias de ADN en el genoma que regulan la expresión de una célula específica.gene.
Si bien la técnica beneficiará principalmente a los investigadores básicos que estén interesados en rastrear la cascada de actividad genética, la red genética, que impacta un gen en el que están interesados, también ayudará a los investigadores a encontrar rápidamente las secuencias reguladoras que controlan la enfermedad.genes y posiblemente encontrar nuevos objetivos para los medicamentos.
"Una enfermedad en la que quizás desee utilizar este enfoque es el cáncer, donde conocemos ciertos genes que esas células cancerosas expresan y necesitan expresar para sobrevivir y crecer", dijo Nicholas Ingolia, profesor asociado de UC Berkeley dey biología celular. "Lo que esta herramienta le permitiría hacer es hacer la pregunta: ¿Cuáles son los genes ascendentes, cuáles son los reguladores que controlan esos genes que conocemos?"
Es posible que sea más fácil apuntar terapéuticamente a esos controladores para apagar las células cancerosas.
La nueva técnica simplifica algo que ha sido difícil de hacer hasta ahora: retroceder por las vías genéticas en una célula para encontrar estos controladores definitivos.
"Tenemos muchas buenas formas de trabajar hacia adelante", dijo. "Esta es una buena forma de trabajar hacia atrás, descubrir qué es lo que está en la fase inicial de algo. Creo que tiene muchos usos potenciales en la investigación de enfermedades".
"A veces utilizo la analogía de que cuando entramos en una habitación oscura y activamos un interruptor de luz, podemos ver qué luz se enciende. Esa luz es como un gen, y podemos decir, cuando activamos el interruptor, quégenes que enciende. Ya somos muy buenos en eso ", agregó." Lo que esto nos permite hacer es trabajar hacia atrás. Si tenemos una luz que nos importa, queremos averiguar cuáles son los interruptores que la controlan.nos da una forma de hacerlo ".
Ryan Muller, un estudiante de posgrado en el laboratorio de Ingolia, y sus colegas Lucas Ferguson y Zuriah Meacham, junto con Ingolia, publicarán los detalles de su técnica en línea el 10 de diciembre en la revista ciencia .
código de barras del genoma
Desde el advenimiento de la edición de genes CRISPR-Cas9 hace ocho años, los investigadores que desean determinar la función de un gen específico han podido apuntarlo con precisión con la proteína Cas9 y eliminarlo. Guiados por un fragmento de ARN guíacomplementaria al ADN en el gen, la proteína Cas9 se une al gen y lo corta o, como ocurre con la interferencia CRISPR CRISPRi, lo inhibe.
En el tipo de ensayo más crudo, la célula u organismo vive o muere. Sin embargo, es posible buscar efectos más sutiles del knockout, como si un gen específico está activado o desactivado, o cuánto está activado.o hacia abajo.
Hoy en día, eso requiere agregar un gen indicador, a menudo uno que codifica una proteína verde fluorescente, unido a una copia idéntica del promotor que inicia la expresión del gen que le interesa. Dado que el promotor único de cada gen determina cuándoese gen se expresa, si el knockout Cas9 afecta la expresión de su gen de interés, también afectará la expresión del reportero, haciendo que el cultivo brille en verde bajo luz fluorescente.
Sin embargo, con 6.000 genes en total en levaduras y 20.000 genes en humanos en total, es una gran empresa modificar cada gen y descubrir el efecto en un reportero fluorescente.
"CRISPR facilita el estudio exhaustivo de todos los genes en el genoma y los perturba, pero la gran pregunta es: ¿cómo se pueden leer los efectos de cada una de esas perturbaciones?", Dijo.
Esta nueva técnica, que Ingolia llama interferencia CRISPR con secuenciación del reportero de expresión de código de barras, o CiBER-seq, resuelve ese problema, permitiendo que estos experimentos se realicen simultáneamente al combinar decenas de miles de experimentos CRISPR. La técnica elimina la fluorescencia yemplea secuenciación profunda para medir directamente la actividad aumentada o disminuida de los genes en el conjunto. La secuenciación profunda utiliza tecnología de secuenciación de próxima generación de lectura larga y alto rendimiento para secuenciar y, esencialmente, contar todos los genes expresados en las muestras agrupadas.
"En un experimento combinado de CiBER-seq, en un día, podemos encontrar todos los reguladores ascendentes para varios genes diana diferentes, mientras que, si utilizara una técnica basada en fluorescencia, cada uno de esos objetivos le llevaría varios díasdel tiempo de medición ", dijo Ingolia.
Hacer CRISPR de cada gen en un organismo en paralelo es sencillo, gracias a las empresas que venden ARN de guía única listos para usar para usar con la proteína Cas9. Los investigadores pueden solicitar ARNsg para cada gen en el genoma, y para cada gen, una docenasgRNA diferentes: la mayoría de los genes son cadenas de miles de nucleótidos, mientras que los sgRNA tienen una longitud de aproximadamente 20 nucleótidos.
La innovación clave del equipo fue vincular cada sgRNA con una secuencia de nucleótidos aleatoria única, esencialmente, un código de barras, conectada a un promotor que solo transcribirá el código de barras si el gen de interés también está activado. Cada código de barras informa sobreel efecto de un sgRNA, que se dirige individualmente a un gen de un conjunto complejo de miles de sgRNA. La secuenciación profunda le indica la abundancia relativa de cada código de barras en la muestra para levadura, unos 60.000, lo que le permite evaluar rápidamente cuál de los6.000 genes en levadura tienen un efecto sobre el promotor y, por lo tanto, la expresión del gen de interés. Para las células humanas, un investigador puede insertar más de 200.000 ARN guía diferentes, dirigidos a cada gen varias veces.
"Este es realmente el meollo de lo que pudimos hacer de manera diferente: la idea de que tiene una gran biblioteca de diferentes ARN guía, cada uno de los cuales va a perturbar un gen diferente, pero tiene el mismo promotor de consulta.- la respuesta que estás estudiando. Ese promotor de consultas transcribe el código de barras aleatorio que vinculamos a cada guía ", dijo." Si hay una respuesta que te interesa, pinchas cada gen diferente en el genoma y ves cómo cambia la respuesta. "
Si obtiene un código de barras que es 10 veces más abundante que cualquiera de los demás, por ejemplo, eso le indica que ese promotor de consultas está activado 10 veces más fuertemente en esa celda. En la práctica, Ingolia adjuntó aproximadamente cuatro códigos de barras diferentes acada ARN guía, como una verificación cuádruple de los resultados.
"Al observar más directamente una respuesta de expresión génica, podemos captar mucha sutileza de la fisiología misma, lo que está sucediendo dentro de la célula", dijo.
En los experimentos recientemente informados, el equipo investigó cinco genes separados en levadura, incluidos genes involucrados en el metabolismo, la división celular y la respuesta celular al estrés. Si bien es posible estudiar hasta 100 genes simultáneamente cuando se realiza CRISPR en todo el genoma,sospecha que, por conveniencia, los investigadores se limitarían a cuatro o cinco a la vez.
El trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud DP2 CA195768, R01 GM130996.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Universidad de California - Berkeley . Original escrito por Robert Sanders. Nota: el contenido se puede editar por estilo y longitud.
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