el ADN, o ácido desoxirribonucleico, transporta información genética en los cromosomas de los núcleos celulares y en las mitocondrias. El ADN es una doble hélice compuesta por dos cadenas largas y enrolladas de cadenas polinucleotídicas. Las cadenas están compuestas por cuatro desoxirribonucleósidos diferentes unidos entre sí a través deenlaces fosfato: desoxiadenosina dA, desoxitimidina dT, desoxicitidina dC y desoxiguanosina dG.
Cuando el ADN se replica durante la división celular o cuando requiere reparación, las enzimas de la ADN polimerasa producen una nueva cadena de ADN, utilizando desoxirribonucleósidos trifosfatos dNTP como bloques de construcción. La energía necesaria para esta síntesis proviene de la energía química cargada en elenlaces fosfato de los dNTP.
Con técnicas previamente disponibles, medir la concentración de dNTP ha sido un desafío, particularmente en el caso de muestras con poca síntesis de ADN y, por lo tanto, una baja concentración de dNTP. Ahora, los investigadores han desarrollado una técnica que permite medir las concentraciones de dNTP con una sensibilidad mucho mejor, por ejemplo, de pequeñas muestras de tejido recolectadas de ratones.
El estudio fue publicado en el Investigación de ácidos nucleicos diario
"Nuestro ensayo se basa en la ADN polimerasa y otros materiales comúnmente utilizados en los laboratorios de biología molecular. El ensayo no requiere equipo especial ni sustancias radiactivas", dice Docent Jukka Kallijärvi.
Un método sensible necesario para investigar enfermedades mitocondriales
Las mitocondrias son orgánulos que son responsables de la respiración celular, pero también tienen muchas otras funciones. La síntesis de nucleósidos de pirimidina, como la timidina y la citidina, depende directamente de la cadena respiratoria mitocondrial. En las enfermedades mitocondriales, la deficiencia en la cadena respiratoriala función puede causar alteraciones en la biosíntesis de nucleósidos y sus nucleótidos fosforilados.
En las células que se dividen rápidamente, como las de la médula ósea y el tejido canceroso, las concentraciones de dNTP son altas, mientras que en las células que se dividen lentamente o en absoluto, como las células del hígado y los músculos, las concentraciones son muy bajas. Sin embargo, todaslas células necesitan algunos dNTP para reparar el daño del ADN y mantener el ADN mitocondrial.
En pacientes que padecen una enfermedad mitocondrial conocida como síndrome GRACILE y en su modelo de ratón, los síntomas principales aparecen en el hígado y los riñones. Estos tejidos tienen pocas células en división y, por lo tanto, también una baja concentración de dNTP.
"Comencé a medir la cantidad de dNTP en el tejido del ratón y rápidamente me di cuenta de que el método anterior no era adecuado para muestras de tejido", dice la estudiante de doctorado Janne Purhonen.
Un nuevo ensayo robusto y sensible resolvió el problema
En el nuevo ensayo dNTP desarrollado por los investigadores, las innovaciones significativas incluyeron el uso de una ADN polimerasa, que tolera las impurezas en la muestra, así como la utilización de un tinte fluorescente sensible que separó el ADN bicatenario del ADN monocatenario.
Uno de los desafíos técnicos fue la alteración potencialmente causada por los ribonucleótidos, los componentes básicos del ARN que pueden ser miles de veces más abundantes que los dNTP en los tejidos.
Al desarrollar la técnica, Purhonen se dio cuenta de que la adición de otra enzima que corta la cadena de ADN en un ribonucleótido agregado erróneamente permite la diferenciación de los productos de reacción correctos y falsos en función de su temperatura de fusión. De esta manera, la señal debida a ribonucleótidos incorporados erróneamente podríaSer eliminado.
El estudio fue realizado por el grupo de investigación GRACILE encabezado por Docent Jukka Kallijärvi y la profesora Emerita Vineta Fellman en el Centro de Investigación Folkhälsan.
"Esperamos que el ensayo resulte útil para los investigadores de enfermedades mitocondriales, así como en otros lugares de la investigación biológica y médica", resume Kallijärvi.
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Materiales proporcionado por Universidad de Helsinki . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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