Las expansiones de repeticiones de ADN son muy difíciles de analizar. Un método desarrollado por investigadores del Instituto Max Planck de Genética Molecular en Berlín permite una visión detallada de estas regiones previamente inaccesibles del genoma. Combina secuenciación de nanoporos, células madre yTecnologías CRISPR-Cas. El método podría mejorar el diagnóstico de diversas enfermedades congénitas y cánceres en el futuro.
Grandes partes del genoma consisten en regiones monótonas donde se repiten secciones cortas del genoma cientos o miles de veces. Pero las expansiones de estas "repeticiones de ADN" en los lugares equivocados pueden tener consecuencias dramáticas, como en pacientes con síndrome de X frágil, unode las causas hereditarias de discapacidad cognitiva más comúnmente identificables en los humanos. Sin embargo, estas regiones repetitivas todavía se consideran un territorio desconocido que no se puede examinar adecuadamente, incluso con métodos modernos.
Un equipo de investigación dirigido por Franz-Josef Müller en el Instituto Max Planck de Genética Molecular en Berlín y el Hospital Universitario de Schleswig-Holstein en Kiel recientemente arrojó luz sobre esta región inaccesible del genoma. El equipo de Müller fue el primero en determinar con éxitoLa longitud de las repeticiones en tándem genómico en cultivos de células madre derivadas de pacientes. Los investigadores también obtuvieron datos sobre el estado epigenético de las repeticiones escaneando moléculas de ADN individuales. El método, que se basa en la secuencia de nanoporos y las tecnologías CRISPR-Cas, abre la puertapara la investigación de regiones genómicas repetitivas y el diagnóstico rápido y preciso de una variedad de enfermedades.
Un defecto genético en el cromosoma X
En el síndrome X frágil, una secuencia repetida se ha expandido en un gen llamado FMR1 en el cromosoma X. "La célula reconoce la región repetitiva y la apaga uniendo grupos metilo al ADN", dice Müller. Estos pequeños cambios químicos tienenun efecto epigenético porque dejan intacta la información genética subyacente. "Desafortunadamente, las marcas epigenéticas se extienden a todo el gen, que luego se apaga por completo", explica Müller. Se sabe que el gen es esencial para el desarrollo normal del cerebro.: "Sin el gen FMR1, vemos retrasos severos en el desarrollo que conducen a diversos grados de discapacidad intelectual o autismo".
En la mayoría de los casos, los individuos femeninos se ven menos afectados por la enfermedad, ya que la región de repetición generalmente se encuentra solo en uno de los dos cromosomas X. Dado que la segunda copia sin cambios del gen no está alterada epigenéticamente, es capaz de compensarpara el defecto genético. Por el contrario, los hombres tienen un solo cromosoma X y una copia del gen afectado y muestran la gama completa de síntomas clínicos. El síndrome es una de las 30 enfermedades causadas por la expansión de repeticiones en tándem cortas.
primer mapeo preciso de repeticiones en tándem cortas
En este estudio, Müller y su equipo investigaron el genoma de las células madre derivadas del tejido del paciente. Pudieron determinar la longitud de las regiones repetidas y su firma epigenética, una hazaña que no había sido posible con los métodos de secuenciación convencionalesLos investigadores también descubrieron que la longitud de la región repetitiva podría variar en gran medida, incluso entre las células de un solo paciente.
Los investigadores también probaron su proceso con células derivadas de pacientes que contenían una repetición expandida en una de las dos copias del gen C9orf72. Esta mutación conduce a una de las causas monogénicas más comunes de demencia frontotemporal y esclerosis lateral amiotrófica ".fueron los primeros en mapear toda la epigenética de las regiones repetidas extendidas y sin cambios en un solo experimento ", dice Müller. Además, la región de interés en la molécula de ADN permaneció completamente inalterada físicamente." Desarrollamos un método único para el análisis de moléculas individualesy para las regiones más oscuras de nuestro genoma, eso es lo que hace que esto sea tan emocionante para mí "
Poros diminutos escanean moléculas individuales
"Los métodos convencionales son limitados cuando se trata de secuencias de ADN altamente repetitivas. Sin mencionar la incapacidad de detectar simultáneamente las propiedades epigenéticas de las repeticiones", dice Björn Brändl, uno de los primeros autores de la publicación. Por eso los científicos usaron Nanoporetecnología de secuenciación, que es capaz de analizar estas regiones. El ADN está fragmentado, y cada hebra se enhebra a través de uno de los cien pequeños agujeros "nanoporos" en un chip de silicio. Al mismo tiempo, las partículas cargadas eléctricamente fluyen a través de los poros.y genera una corriente. Cuando una molécula de ADN se mueve a través de uno de estos poros, la corriente varía según las propiedades químicas del ADN. Estas fluctuaciones de la señal eléctrica son suficientes para que la computadora reconstruya la secuencia genética y las etiquetas químicas epigenéticas.Este proceso tiene lugar en cada poro y, por lo tanto, en cada cadena de ADN.
Las herramientas de edición del genoma y la bioinformática iluminan la "materia oscura"
Los métodos de secuenciación convencionales analizan todo el genoma de un paciente. Ahora, los científicos diseñaron un proceso para observar regiones específicas de manera selectiva. Brändl utilizó el sistema CRISPR-Cas para cortar segmentos de ADN del genoma que contenía la región repetida.a través de unos pocos pasos intermedios de procesamiento y luego se canalizaron hacia los poros en el chip de secuenciación.
"Si no hubiéramos ordenado previamente las moléculas de esta manera, su señal se habría ahogado en el ruido del resto del genoma", dice el bioinformático Pay Giesselmann. Tuvo que desarrollar un algoritmo específicamente para la interpretación de la molécula.señales eléctricas generadas por las repeticiones: "La mayoría de los algoritmos fallan porque no esperan los patrones regulares de secuencias repetitivas". Si bien el programa "STRique" de Giesselmann no determina la secuencia genética en sí, cuenta el número de repeticiones de secuencia con alta precisión.El programa está disponible gratuitamente en Internet.
Numerosas aplicaciones potenciales en la investigación y la clínica
"Con el sistema CRISPR-Cas y nuestros algoritmos, podemos examinar cualquier sección del genoma, especialmente aquellas regiones que son particularmente difíciles de examinar utilizando métodos convencionales", dice Müller, quien dirige el proyecto. "Creamos elherramientas que permiten a cada investigador explorar la materia oscura del genoma ", dice Müller. Él ve un gran potencial para la investigación básica." Hay evidencia de que las repeticiones crecen durante el desarrollo del sistema nervioso, y nos gustaría profundizarmira este."
El médico también prevé numerosas aplicaciones en el diagnóstico clínico. Después de todo, las regiones repetitivas están involucradas en el desarrollo del cáncer, y el nuevo método es relativamente económico y rápido. Müller está decidido a llevar el procedimiento al siguiente nivel: "Estamosmuy cerca de la aplicación clínica "
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Materiales proporcionado por Max-Planck-Gesellschaft . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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