Nuestros cerebros contienen millones de sinapsis, las conexiones que transmiten mensajes de neurona a neurona. Dentro de estas sinapsis hay cientos de proteínas diferentes, y la disfunción de estas proteínas puede conducir a afecciones como la esquizofrenia y el autismo.
Los investigadores del MIT y el Broad Institute of Harvard y el MIT han ideado una nueva forma de obtener rápidamente imágenes de estas proteínas sinápticas en alta resolución. Utilizando sondas fluorescentes de ácido nucleico, pueden etiquetar e obtener imágenes de un número ilimitado de proteínas diferentes.técnica en un nuevo estudio en el que obtuvieron imágenes de 12 proteínas en muestras celulares que contienen miles de sinapsis.
"Las imágenes multiplexadas son importantes porque hay mucha variabilidad entre las sinapsis y las células, incluso dentro del mismo cerebro", dice Mark Bathe, profesor asociado de ingeniería biológica del MIT. "Realmente hay que mirar simultáneamente las proteínas en la muestra para comprendercómo se ven las subpoblaciones de diferentes sinapsis, descubrir nuevos tipos de sinapsis y comprender cómo las variaciones genéticas los afectan "
Los investigadores planean usar esta técnica para estudiar qué sucede con las sinapsis cuando bloquean la expresión de genes asociados con enfermedades específicas, con la esperanza de desarrollar nuevos tratamientos que puedan revertir esos efectos.
Bathe y Jeff Cottrell, director de investigación traslacional en el Centro Stanley de Investigación Psiquiátrica en el Broad Institute, son los autores principales del estudio, que aparece hoy en Comunicaciones de la naturaleza . Los autores principales del artículo son los ex postdocs Syuan-Ming Guo y Remi Veneziano, el ex estudiante graduado Simon Gordonov y el ex científico investigador Li Li.
Imágenes con ADN
Las proteínas sinápticas tienen una variedad de funciones. Muchas de ellas ayudan a formar andamios sinápticos, que están involucrados en la secreción de neurotransmisores y el procesamiento de las señales entrantes. Mientras que las sinapsis contienen cientos de estas proteínas, la microscopía de fluorescencia convencional se limita a la obtención de imágenes en la mayoría de las cuatro proteínas enun momento.
Para aumentar ese número, el equipo del MIT desarrolló una nueva técnica basada en un método existente llamado DNA PAINT. Utilizando este método, ideado originalmente por Ralf Jungmann del Instituto de Bioquímica Max Planck, los investigadores etiquetan las proteínas u otras moléculas de interés con unSonda de ADN-anticuerpo. Luego, toman imágenes de cada proteína mediante la entrega de un "oligo" de ADN fluorescente que se une a las sondas de ADN-anticuerpo.
Las cadenas de ADN tienen una afinidad inherentemente baja entre sí, por lo que se unen y desenlazan periódicamente, creando imágenes de fluorescencia parpadeante con microscopía de súper resolución. Sin embargo, la obtención de imágenes de cada proteína toma aproximadamente media hora, por lo que no es práctico para la obtención de imágenesmuchas proteínas en una muestra grande
Bathe y sus colegas se propusieron crear un método más rápido que les permitiera analizar una gran cantidad de muestras en un corto período de tiempo. Para lograr eso, alteraron la sonda de imágenes de ADN para que se uniera más firmementeal ADN-anticuerpo, usando lo que se llama ácidos nucleicos bloqueados. Esto proporciona una señal mucho más brillante, por lo que la imagen se puede hacer más rápidamente, pero a una resolución ligeramente más baja.
"Cuando hacemos 12 o 15 colores en un solo pozo de neuronas, todo el experimento lleva una hora, en comparación con la noche a la mañana para el equivalente de superresolución", dice Bathe.
Los investigadores utilizaron esta técnica para etiquetar 12 proteínas diferentes que se encuentran en la sinapsis, incluidas las proteínas de andamiaje, las proteínas asociadas con el citoesqueleto y las proteínas que se sabe que marcan las sinapsis excitadoras o inhibidoras. Una de las proteínas que observaron es shank3, unproteína de armazón que se ha relacionado tanto con el autismo como con la esquizofrenia.
Al analizar los niveles de proteínas en miles de neuronas, los investigadores pudieron determinar grupos de proteínas que tienden a asociarse entre sí con más frecuencia que otras, y aprender cómo varían las diferentes sinapsis en las proteínas que contienen. Ese tipo de información podríausarse para ayudar a clasificar las sinapsis en subtipos que podrían ayudar a revelar sus funciones.
"Inhibitorios y excitatorios son los tipos de sinapsis canónicas, pero se especula que existen numerosos subtipos diferentes de sinapsis, sin ningún consenso real sobre cuáles son", dice Bathe.
Entendiendo la enfermedad
Los investigadores también demostraron que podían medir los cambios en los niveles de proteínas sinápticas que ocurren después de que las neuronas son tratadas con un compuesto llamado tetrodotoxina TTX, que fortalece las conexiones sinápticas.
"Utilizando la inmunofluorescencia convencional, normalmente puede extraer información de tres o cuatro objetivos dentro de la misma muestra, pero con nuestra técnica, pudimos expandir ese número a 12 objetivos diferentes dentro de la misma muestra. Aplicamos este método para examinar la sinápticaremodelación que ocurre después del tratamiento con TTX, y nuestro hallazgo corroboró el trabajo previo que reveló una regulación ascendente coordinada de proteínas sinápticas después del tratamiento con TTX ", dice Eric Danielson, un postdoctorado senior del MIT que es autor del estudio.
Los investigadores ahora están utilizando esta técnica, llamada PRISM, para estudiar cómo la estructura y composición de las sinapsis se ven afectadas al eliminar genes asociados con diversos trastornos. La secuenciación de los genomas de personas con trastornos como el autismo y la esquizofrenia ha revelado cientos de enfermedadesvariantes genéticas ligadas, y para la mayoría de esas variantes, los científicos no tienen idea de cómo contribuyen a la enfermedad.
"Comprender cómo la variación genética afecta el desarrollo de las neuronas en el cerebro, y su estructura y función sinápticas, es un gran desafío en la neurociencia y en comprender cómo surgen estas enfermedades", dice Bathe.
La investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud, que incluyen la Iniciativa NIH BRAIN, la Fundación Nacional de Ciencias, el Programa de Estudiantes de la Facultad Simons del Instituto Médico Howard Hughes, el Proyecto de Filantropía Abierta, el Laboratorio de Investigación del Ejército de EE. UU., La Célula Madre de Nueva YorkPremio Robertson de la Fundación y el Centro Stanley de Investigación Psiquiátrica.
Otros autores del artículo incluyen a la científica investigadora del Instituto Broad Karen Pérez de Arce, la científica investigadora del MIT Demian Park, el ex estudiante de posgrado del MIT Anthony Kulesa, y el postdoc MIT Eike-Christian Wamhoff. Paul Blainey, profesor asociado de ingeniería biológica y miembrodel Broad Institute, y Edward Boyden, el profesor Y. Eva Tan de Neurotecnología y profesor asociado de ingeniería biológica y de ciencias cerebrales y cognitivas, también son autores del estudio.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Instituto de Tecnología de Massachusetts . Original escrito por Anne Trafton. Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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