El poder y la conveniencia de los programas modernos de procesamiento de texto, como Microsoft Word, han revolucionado nuestras tareas diarias. ¿Necesitas crear un currículum rápido para una nueva oportunidad de trabajo? ¿Dilusiones sobre ese trabajo final para mañana? Incluso crear un rápidoLista de compras: la mayoría de nosotros confiamos en los programas de procesamiento de texto como administradores de nuestras vidas escritas. La funcionalidad es impresionante y, a diferencia de su arcaico predecesor, el escritor de tipos, solo unas pocas teclas pueden cambiar, eliminar o agregar palabras según lo desee el usuario.
Durante años, los investigadores han estado buscando formas de imitar estas capacidades, pero en la escala genética, para alterar con precisión y eficiencia la información genética. El desarrollo de una "Palabra de ADN de Microsoft", permitiría a los científicos la oportunidad de estudiar mejor el funcionamiento degenes individuales y las mutaciones que contribuyen a los trastornos genéticos. Con un solo descubrimiento, llamado CRISPR-Cas9, los científicos fueron mejorados para siempre de máquinas de escribir de ADN a un procesador de textos de ADN; editando genes con la misma facilidad, precisión y versatilidad. La tecnología ha ganadoinmensa tracción y popularidad debido a su flexibilidad y naturaleza personalizable.
Aunque potente, CRISPR está lejos de ser una técnica perfecta y tiene sus inconvenientes y limitaciones como uno cualquiera. Uno de sus usos principales, consiste en apuntar y mutar con precisión un gen de interés para que ya no funcione dentro de un tipo específico de célulaCuando un gen se vuelve no funcional, cualquier cambio característico en la célula conocido como fenotipos puede estudiarse para tener una mejor idea de lo que hace ese gen en particular, pero la forma en que CRISPR muta genes individuales puede ser un desafío para los investigadores.Cuando se coloca en una célula, el sistema CRISPR-Cas9 muta con precisión un gen objetivo cortando el ADN de la célula. Luego, la célula repara su ADN roto predominantemente a través de un proceso llamado unión de extremo no homólogo NHEJ. Pero este proceso de reparación es propenso a errores ypuede causar variabilidad en el ADN reparado, lo que a menudo conduce a sustituciones, supresiones o adiciones al código genético. Además, el desafío es que la eficiencia de CRISPR puede variar, actuando para generar ambas copiasde un gen dirigido no funcional o, a veces, solo uno.Estos cambios de ADN causados por CRISPR desconocidos pueden hacer que sea extremadamente difícil para los científicos interpretar la causa genética subyacente de un fenotipo observado;haciendo que la herramienta sea mucho menos útil.
En una publicación reciente en Informes de celda , el Laboratorio Taniguchi en el Instituto Max Planck de Florida para la Neurociencia MPFI ha desarrollado una nueva metodología que permite la vinculación del fenotipo con el genotipo. Combinando de manera innovadora la técnica de vanguardia de la microdisección láser con el genotipo de células individuales, el Laboratorio Taniguchi tienediseñó una tubería experimental capaz de estudiar los efectos mediados por CRISPR en las células mientras se determinan con precisión los cambios exactos en el ADN que los causaron. Este novedoso protocolo abrirá nuevas vías de estudio para la neurobiología y mejorará aún más las capacidades ya poderosas de CRISPR.
"Aunque CRISPR se dirige con precisión a un gen de interés, debido a NHEJ, sus efectos pueden ser muy variables", explica Andre Steinecke, Ph.D., Research Fellow y primer autor de la publicación. "CRISPR puede dejar células completamentegenes no funcionales, genes debilitados o incluso a veces mejoran su función. Esto no es un problema cuando se elimina uno que causa un efecto muy notable en las células porque puede visualizar fácilmente el cambio y la ausencia de la proteína codificada por el gen. Pero algunos,especialmente los genes en el cerebro, no tienen efectos sorprendentemente obvios o son muy difíciles de visualizar. Nuestro objetivo era crear una estrategia ampliamente aplicable, capaz de determinar de manera confiable la causa genética exacta y correlacionarla con el fenotipo observado ".
Para validar su estrategia, el equipo de MPFI diseñó la tecnología CRISPR para apuntar a un gen en neuronas piramidales que codifica una proteína estructural crítica, llamada Ankyrin-G AnkG. Normalmente, la proteína AnkG está confinada a una región especializada de la neurona conocidacomo el segmento inicial del axón AIS, que es responsable de generar potenciales de acción. Cuando se elimina AnkG, el AIS sufre un notable engrosamiento que puede detectarse mediante microscopía. Con esta característica, las neuronas que carecen de AnkG pueden distinguirse fácilmente y suluego se pudo confirmar el genotipo exacto. Descubrieron que predominantemente, las neuronas transfectadas con su sonda CRISPR exhibían una pérdida de AnkG así como un AIS sustancialmente engrosado. Pero una pequeña porción de neuronas transfectadas con CRISPR aún exhibía niveles de AnkG y un grosor de AIS comparable con las neuronas de tipo salvaje.; demostrando los diversos efectos de CRISPR en diferentes células. Para investigar y confirmar las causas genéticas subyacentes, el equipo utilizóMicrodisección láser para aislar y extraer neuronas individuales cuyo fenotipo ya se ha caracterizado.Una vez extraído, el equipo secuencia cada célula individual por separado para determinar el genotipo.Descubrieron que su estrategia podía vincular de manera confiable y reproducible el fenotipo observado con el genotipo, donde las neuronas que carecen de AnkG con axones engrosados mostraron mutaciones de pérdida de función en ambas copias del gen, mientras que las neuronas con niveles normales de AnkG mostraron mutaciones en una sola copia neuronas transfectadas con CRISPR o genotipos normales neuronas de control.Luego, el equipo confirmó su estrategia utilizando dos genes adicionales, MeCP2 y Satb2, y descubrió que su proceso podría volver a correlacionar efectivamente la característica observada con la genética subyacente.
"La orientación de genes basada en CRISPR / Cas9 es muy prometedora para la comprensión sistemática de la base molecular que subyace al ensamblaje, función y disfunción de los circuitos neuronales", señala Hiroki Taniguchi, Ph.D. "La combinación perfecta entre genotipos determinada por nuestroLa secuenciación de células individuales y las deducidas de la evaluación de fenotipos sugiere que nuestro enfoque es un método nuevo y poderoso capaz de mejorar la confiabilidad y expandir las aplicaciones de las técnicas basadas en CRISPR ".
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Materiales proporcionado por Instituto Max Planck de Florida para la Neurociencia . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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