El sistema CRISPR / Cas9 ha estado haciendo ondas en la comunidad científica desde que se propusieron sus mecanismos en 2012. Comúnmente conocido como una herramienta de edición del genoma, muchos científicos han encontrado diferentes aplicaciones para las propiedades tipo tijera de la proteína Cas9Investigadores del Instituto Leibniz de Genética de Plantas e Investigación de Plantas de Cultivo IPK Gatersleben ahora han encontrado una manera de utilizar el complejo ARN / proteína de una manera ligeramente diferente, como una antorcha citogenética. Aparte de la hibridación in situ convencional, laLa nueva herramienta de etiquetado in situ de endonucleasa guiada por ARN RGEN-ISL ya no requiere desnaturalización del ADN. Por lo tanto, el nuevo método deja la cromatina intacta, permitiendo la investigación de la estructura de la muestra. Además, RGEN-ISL puede sercombinado con métodos de detección de proteínas y permite la visualización en tiempo real del proceso de etiquetado.Inicialmente desarrollado para genomas de plantas, RGEN-ISL puede usarse en todos los organismos y demuestra ser una nueva y prometedoraherramienta en el campo de la biología cromosómica.
El descubrimiento del sistema caspasa 9 Cas9 asociado a repeticiones palindrómicas cortas y agrupadas regularmente espaciadas de tipo II ha sido un hito en el campo de la edición dirigida del genoma. Inicialmente derivado de la bacteria Streptococcus pyogenes , el complejo ARN / proteína ahora es una herramienta establecida para la edición dirigida del genoma en eucariotas.
Si bien sus propiedades en forma de tijera han producido una amplia gama de aplicaciones, los científicos del Instituto Leibniz de Genética Vegetal y de Investigación de Cultivos IPK Gatersleben ahora están utilizando CRISPR / Cas9 en un nuevo método citogenético para iluminar los genomas eucariotas.- Endonucleasa guiada por ARN - etiquetado in situ RGEN-ISL.
Durante los últimos 30 años, la hibridación fluorescente in situ FISH ha sido el método establecido y comúnmente utilizado para visualizar secuencias de ADN in situ a nivel cromosómico. Sin embargo, este método requiere la desnaturalización del ADN investigado, lo que a menudo daña elestructura de la muestra. Al basar el método RGEN-ISL en CRISPR-Cas9, los investigadores de IPK lograron eludir el paso de desnaturalización de FISH al tiempo que integraban simultáneamente las propiedades de marcado fluorescente deseadas del método FISH convencional. Como la nueva herramienta citogenética preserva elestructura de la muestra, abre la opción de investigar la estructura espacio-temporal del genoma.
La experimentación adicional demostró que RGEN-ISL supera a las combinaciones de métodos convencionales, como FISH e inmunohistoquímica, que requieren menos preparación y son comparativamente más rápidas y baratas. Además, el nuevo método funciona en un amplio rango de temperaturas de 4 ° C a 37 ° Cy también se puede combinar con métodos adicionales de detección e imagen de proteínas. Un mérito adicional es que RGEN-ISL permite la visualización en tiempo real del etiquetado de ADN mediado por CRISPR / Cas9, revelando así la cinética de la reacción.
Hasta ahora, los investigadores han probado RGEN-ISL en muestras de plantas, pero también en cromosomas humanos, lo que ilustra que su nuevo método probablemente puede aplicarse en todos los organismos. Actualmente, el uso del método se limita a secuencias de ADN repetitivas, ya quea menudo se encuentra en genomas de plantas. Sin embargo, el Dr. Takayoshi Ishii, que ahora trabaja en la Universidad de Tottori Japón, quien concibió la idea inicial detrás de RGEN-ISL, supone que este método podría adaptarse para visualizar incluso secuencias de una sola copia en el futuro.
El proyecto en torno al nuevo método, que fue desarrollado bajo la dirección del grupo de investigación Dr. Andreas Houben, fue posible gracias a una donación a CSIRO Australia por parte de la Fundación Bill y Melinda Gates EE. UU., Así como gracias a la financiación adicional delFundación Alemana de Investigación - DFG Alemania.
Dadas sus propiedades y su amplia aplicabilidad, RGEN-ISL es una nueva herramienta citogenética prometedora para fomentar la comprensión de la organización espacial del genoma y la conexión entre la estructura y la función de la cromatina, así como para avanzar en el conocimiento dentro del amplio campo debiología cromosómica.
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Materiales proporcionado por Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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