En el último de los esfuerzos en curso para expandir las tecnologías para modificar genes y su expresión, los investigadores del laboratorio de Neville Sanjana, PhD, en el Centro del Genoma de Nueva York NYGC y la Universidad de Nueva York NYU han desarrollado ARN guía químicamente modificadospara un sistema CRISPR que se dirige al ARN en lugar de al ADN. Estos ARN guía modificados químicamente mejoran significativamente la capacidad de apuntar rastrear, editar y / o eliminar ARN en células humanas.
en un estudio publicado hoy en Biología química celular , el equipo explora una gama de diferentes modificaciones de ARN y detalla cómo las guías modificadas aumentan la eficiencia de la actividad CRISPR de 2 a 5 veces en comparación con las guías no modificadas. También muestran que las modificaciones químicas optimizadas extienden la actividad de selección de CRISPR de 48 horas acuatro días. Los investigadores trabajaron en colaboración con científicos de Synthego Corporation y New England BioLabs, reuniendo a un equipo diverso con experiencia en la purificación de enzimas y la química del ARN. Para aplicar estas modificaciones químicas optimizadas, el equipo de investigación se centró en los receptores de la superficie celular en las células T humanasde donantes sanos y un segmento "universal" de la secuencia genética compartida por todas las variantes conocidas del virus ARN SARS-COV-2, responsable de la pandemia de COVID-19.
Aumentar la eficiencia y la "vida" de las guías CRISPR-Cas13 es de valor crítico para los investigadores y desarrolladores de fármacos, ya que permite una mejor eliminación de genes y más tiempo para estudiar cómo el gen influye en otros genes en vías relacionadas.
"La entrega de la guía de ARN CRISPR puede ser un desafío, con un tiempo de eliminación limitado debido a la rápida degradación de la guía. Nos inspiraron las modificaciones de la guía desarrolladas para otros CRISPR dirigidos al ADN y queríamos probar si las guías modificadas químicamente podrían mejorar el tiempo de eliminación para el ARN-apuntando a CRISPR-Cas13 en células humanas ", dice Alejandro Méndez-Mancilla, PhD, científico postdoctoral en el laboratorio y co-primer autor del estudio.
Basado en el estudio anterior del laboratorio que describió los principios para el diseño óptimo de la guía Cas13, publicado en Biotecnología de la naturaleza en marzo de 2020, los investigadores aplicaron y probaron sistemáticamente una variedad de modificaciones químicas. Por ejemplo, encontraron que agregar 3 bases con un tipo diferente de enlace químico que las unía entre sí modificación de fosforotioato extendía la capacidad de eliminación del objetivo del ARN en variosdías en una línea celular humana. En las células T primarias, la modificación del fosforotioato resultó en una reducción del 60-65% de la expresión de CD46, un receptor involucrado en la regulación del sistema inmunológico, en comparación con lograr un 40-45% de reducción cuando se usa unguía.
El equipo también descubrió que ciertas modificaciones de metilación y terminación invertida también mejoraron la actividad de Cas13. Para todas las modificaciones, la ubicación de estas bases de ARN modificadas también fue crucial. Cuando se colocaron incorrectamente, las modificaciones dieron como resultado ARN guía que no funcionaron ".Espero que la eficacia y la estabilidad mejoradas de estas guías CRISPR Cas13 modificadas ayuden a allanar el camino para el uso de CRISPR dirigidos al ARN en células primarias ", dice Hans-Hermann Wessels, PhD, científico postdoctoral en el laboratorio y co-primer autorde El estudio.
"Estas guías modificadas amplían aún más la caja de herramientas para la ingeniería del genoma y del transcriptoma. En el caso de los elementos no codificantes del genoma humano, el ADN dirigido al ADN puede no ser efectivo y otros organismos, como los virus de ARN como el coronavirus o la gripe, no pueden ser dirigidos atodos ", dijo el Dr. Sanjana, miembro principal de la facultad, NYGC, profesor asistente de biología, NYU, y profesor asistente de neurociencia y fisiología, NYU Grossman School of Medicine, autor principal del estudio.
La prueba del equipo para eliminar el segmento de la secuencia líder universal del virus ARN SARS-CoV-2 en células humanas, por ejemplo, solo es posible usando un CRISPR dirigido al ARN como Cas13. El SARS-CoV-2 ingresa a las células y liberasu genoma de ARN, que luego se transcribe en ARN más pequeños, denominados ARN subgenómicos. Estos ARN subgenómicos son responsables de producir las diferentes proteínas necesarias para que el virus se replique y luego infecte otras células. La secuencia líder universal se encuentra al comienzo decada ARN subgenómico. Por lo tanto, un enfoque eficaz para dirigirse a la secuencia líder universal puede proteger a las células contra una mayor replicación e infección viral.
También es de importancia fundamental la capacidad de CRISPR-Cas13 para modular la expresión genética sin alterar permanentemente la secuencia del genoma del ADN subyacente, al igual que los CRISPR dirigidos al ADN como Cas9 o Cas12a. "La modulación transitoria para estimular los resultados de la expresión genética a menudo se prefiere en la investigación biomédica ydesarrollo de fármacos. Por ejemplo, las vacunas de ARN mensajero para el SARS-CoV-2 se expresan de forma transitoria pero crean una memoria inmunitaria que dura más allá de su expresión ", señala el Dr. Sanjana.
Coautores del Biología química celular el estudio incluye Mateusz Legut, PhD, científico postdoctoral en el laboratorio; Anastasia Kadina, PhD, Científica sénior, Investigación en Química, Synthego Corporation; Megumu Mabuchi, Científico Asociado, Biología de ARN y Edición del Genoma, BioLabs de Nueva Inglaterra; John Walker,PhD, Director de Investigación Química, Synthego Corporation; G. Brett Robb, PhD, Director Científico, Edición de ARN y Genoma, y Kevin Holden, PhD, Jefe de Ciencias, Synthego Corporation.
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