Durante la última década, la herramienta de edición de genes CRISPR ha transformado la biología y ha abierto caminos esperanzadores para corregir enfermedades hereditarias mortales. El otoño pasado, los científicos comenzaron los primeros ensayos clínicos en humanos usando CRISPR para combatir enfermedades como el cáncer. Eliminan algunos de los síntomas de una personacélulas, CRISPR editan el ADN y luego inyectan las células nuevamente, donde con suerte curarán la enfermedad.
Pero junto con esta promesa de medicina regenerativa y personalizada, CRISPR también puede tener limitaciones de seguridad significativas. CRISPR puede no editar en el lugar correcto los llamados efectos genéticos fuera del objetivo o no ser terriblemente eficiente la edición exitosa solo puede serlogrado en aproximadamente el 10% del tiempo para cada objetivo de celda disponible.
Estas limitaciones han frustrado a científicos como David Brafman de la Universidad Estatal de Arizona, un bioingeniero celular. Las esperanzas iniciales de Brafman son utilizar la edición de genes para descubrir las causas de los estudios en su laboratorio de enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer.
"Estudiamos enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer y usamos células madre para estudiar mutaciones específicas o factores de riesgo asociados con la enfermedad de Alzheimer", dijo Brafman, miembro de la facultad de ingeniería biomédica en las Escuelas de Ingeniería Ira A. Fulton de ASU. "No somos necesariamente unlaboratorio de desarrollo de herramientas de edición de genes, pero nos encontramos con dificultades para generar líneas de células madre mediante el uso de un enfoque de edición tradicional basado en CRISPR. Por razones que aún se desconocen, las células madre son realmente resistentes a ese tipo de modificación genética ".
Luz verde significa ir
Ahora, Brafman, utilizando una nueva actualización de la tecnología de edición de base CRISPR desarrollada originalmente en el laboratorio de David Liu en Harvard, ha superado ampliamente los esfuerzos previos al realizar una edición de base de ADN única y altamente precisa con una eficiencia de hasta el 90% decélulas madre humanas. Los resultados fueron publicados en la revista Informes de células madre .
"Anteriormente, con CRISPR, ha sido una suposición aleatoria", dijo Brafman. "Y así, si está seleccionando células madre aleatorias y la eficiencia es baja, es probable que obtenga solo un 10% o 5% porqueno tengo idea si las modificaciones se han realizado, la celda no te lo dice "
El laboratorio de Brafman ha desarrollado un nuevo método TREE un acrónimo abreviado de reportero transitorio para enriquecimiento de edición, o TREE, que permite el enriquecimiento masivo de poblaciones de células editadas con base de ADN, y por primera vez, alta eficiencia en humanoslíneas de células madre.
"" La mayoría de los estudios se realizan en líneas celulares inmortalizadas o líneas celulares cancerosas, que son relativamente fáciles de editar ", dijo Brafman." Este es el primer ejemplo del uso de editores base en células madre pluripotentes, lo cual es muy valiosopoblación celular para modificar genéticamente. Visualizamos que este método tendrá implicaciones importantes para el uso de líneas de células madre humanas en biología del desarrollo, modelado de enfermedades, detección de drogas y aplicaciones de ingeniería de tejidos "
El año pasado, habían demostrado que su enfoque TREE puede funcionar en líneas celulares humanas, pero querían impulsar aún más la tecnología para encontrar una manera de editar rápida y eficientemente las líneas de células madre humanas.
A diferencia de CRISPR, que atraviesa ambos soportes de ADN, su método TREE solo produce una hebra de una sola hebra en el ADN. Por ejemplo, cuando una sola base de ADN se edita con éxito de una C a una T, una proteína emite una señal, girandode azul a verde
"Ahora, si una celda te dice, 'si estoy verde brillante tengo un 90% de posibilidades de ser editado, tendrás más suerte para identificar las poblaciones editadas", dijo Brafman. "Entonces, puedes excluir todode las células que no están editadas. Aislamos las células individuales que son de color verde brillante, luego las cultivamos en poblaciones clonales que puedes expandir indefinidamente ".
dirigido a la enfermedad de Alzheimer
Las células madre pluripotentes se valoran para la medicina regenerativa porque tienen la capacidad de convertirse o diferenciarse en cualquier tipo de célula en el cuerpo humano.
Brafman explica que hay dos fuentes generales, "células madre embrionarias, que se derivan de la masa celular interna de un blastocisto de preimplantación, y luego hay células madre pluripotentes inducidas, que se derivan de tomar células somáticas como la piel o la sangre depacientes "
El laboratorio de Brafman utiliza las células madre pluripotentes inducidas para su investigación.
"Para este estudio, utilizamos células madre pluripotentes de pacientes sanos y luego de pacientes con enfermedad de Alzheimer. Algunos de los genes que estábamos interesados en modular están relacionados con la enfermedad de Alzheimer. La mayoría de los pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer sufren deinicio tardío o enfermedad de Alzheimer esporádica "
Para proporcionar su prueba de concepto, apuntaron al gen APOE, que puede venir en tres sabores. Una de las tres variantes genéticas, llamada APOE4, se ha asociado con un mayor riesgo de enfermedad de Alzheimer de aparición tardía. Para el estudio, introdujeron ediciones únicas basadas en ADN en el gen APOE.
"Es por eso que estamos interesados en tener estas células", dijo Brafman. "Son representativas de las neuronas y los diversos tipos de células en el sistema nervioso central con pacientes con estos diversos factores de riesgo. Entonces, podemos entender por qué un APOEla variante puede aumentar o disminuir el riesgo, y luego podemos comenzar a enfocarnos en las vías afectadas ".
TREE no solo pudo realizar ediciones de ADN individuales en el gen APOE4, sino que, a diferencia de CRISPR, hizo correcciones muy precisas a ambas copias del gen APOE4 que poseen los humanos.
"El enfoque CRISPR tradicional es que hay que editar una vez para obtener una edición heterocigótica, luego aislar ese clon, editar nuevamente para obtener otra edición heterocigótica", dijo Brafman. "Entonces, es muy ineficiente de esa manera. Estamos generandoediciones homocigóticas con una eficiencia cercana al 90%. No he visto ninguna otra tecnología que pueda hacer eso en las células madre pluripotentes ".
Además, TREE también podría usarse para diseñar mutaciones críticas de genes inactivados en líneas de células madre. "El experimento más fundamental que puedes hacer si un gen tiene implicaciones importantes en la enfermedad, el desarrollo o la fisiología es eliminarlo", dijo Brafman.Eso abre un montón de preguntas que podemos abordar. Usando APOE como estudio de caso, ahora podemos eliminar APOE en estas células si no tiene APOE en absoluto. ¿Es beneficioso? ¿Nocivo? ¿O no hay diferencia? "
casos complejos
Si bien las enfermedades como la anemia de células falciformes o la fibrosis quística son causadas por mutaciones únicas en el ADN, para la mayoría de las enfermedades y las principales causas de muerte, como las enfermedades cardíacas o la presión arterial alta, son complejas e involucran múltiples genes. Brafman también quería abordarLas complejas causas de la enfermedad de Alzheimer.
"Especialmente en lo que se refiere a la enfermedad de Alzheimer, puede haber múltiples factores de riesgo que actúan en concierto, por lo que queríamos una forma de introducir múltiples ediciones simultáneamente en células madre pluripotentes. Porque de lo contrario, tendrías que tomar este enfoque secuencial iterativo,donde introduce una edición, aísla una población clonal, introduce otra edición, etc.
Demostraron con éxito que TREE podía usarse para hacer nuevas líneas de células madre que habían sido editadas simultáneamente en múltiples ubicaciones genéticas. Sus resultados mostraron que más del 80% de los clones madre se habían dirigido a los tres sitios genéticos diferentes, y con todosclones que editan ambas copias de genes.
"Descubrimos que si multiplexas aún obtienes la misma eficiencia de edición que si editaras un solo alelo", dijo Brafman. "Ahora, podemos usar estas células como modelos in vitro para estudiar la enfermedad y detectardrogas "
Brafman espera que sus nuevas herramientas generen entusiasmo en la comunidad de edición de genes y estimulen a otros a hacer nuevos descubrimientos.
"Queremos seguir expandiéndonos en esa caja de herramientas", dijo Brafman. "Ya hemos obtenido un alto nivel de interés por parte de otros científicos que utilizarán esto para generar sus propias líneas celulares. Eso es algo bueno".
La financiación para este trabajo fue proporcionada por los Institutos Nacionales de Salud R01GM121698 a David Brafman, R21AG056706 a DAB, R01GM106081 a XW y la Comisión de Investigación Biomédica de Arizona ADHS16-162401 a DAB.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Universidad Estatal de Arizona . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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