La nitidez de un microscopio óptico está limitada por las condiciones físicas: las estructuras que están más juntas que 0.2 milésimas de milímetro se desenfocan entre sí; ya no se pueden distinguir entre sí. La causa de este desenfoque es la difracción: entérminos simples, evita que los rayos de luz no puedan agruparse con precisión arbitraria. Por lo tanto, cada objeto en forma de punto no se muestra como un punto, sino como un "punto borroso".
Con métodos matemáticos, la resolución aún se puede mejorar drásticamente. Uno calcularía su centro exacto a partir de la distribución de brillo del "punto borroso". Sin embargo, solo funciona si dos puntos muy adyacentes del objeto inicialmente no son simultáneos sino posteriormenteson visibles y se fusionan más tarde en el procesamiento de la imagen. Este desacoplamiento temporal evita la superposición de la "mancha borrosa". "Los investigadores en ciencias de la vida han estado utilizando este método complicado durante algunos años, para microscopía óptica de células de muy alta resolución".
Un tipo de este método fue desarrollado en el grupo de investigación del Prof. Dr. Markus Sauer de la Universidad de Würzburg: microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa dSTORM. Esta potente técnica SMLM puede proporcionar una resolución lateral de ~ 20 nm.Para este propósito, ciertas estructuras, por ejemplo, un poro de un núcleo celular, se tiñen con tintes fluorescentes. Cada una de las moléculas de tinte parpadea a intervalos irregulares y representa parte del poro. Por lo tanto, la imagen de los poros nucleares completos no es inicialmentevisible, pero surge después del procesamiento de la imagen mediante la superposición de varios miles de imágenes. Con la técnica dSTORM, la resolución de un microscopio óptico convencional se puede aumentar en un factor de diez ". Permite, por ejemplo, visualizar la arquitectura de uncelular hasta su nivel molecular ", explica Hannah Heil. La investigadora está haciendo su doctorado en el Centro Rudolf Virchow de la Universidad de Würzburg en el grupo del Prof. Katrin Heinze.
Sin embargo, las estadísticas de fotones en sí definen un límite de resolución virtual en resolución. Para abordar este problema, Katrin Heinze tuvo la idea de usar nanocoatings biocompatibles relativamente simples para aumentar la señal. En un esfuerzo conjunto con Markus Sauer y colegas de la facultad deFísica, Hannah Heil diseñó y fabricó nanorevestimientos dieléctricos metálicos que se comportan como un espejo sintonizable. Casi duplica la resolución.
Espejo, espejo en la pared: ¿Qué imagen es la más nítida de todas?
Depositaron con vapor un cubreobjetos, sobre el cual se colocan las células durante la observación, con un fino recubrimiento nano reflectante que consiste en plata y nitrito de silicio transparente. El recubrimiento es biocompatible, por lo que no daña la célula. Con este método,los dos grupos lograron dos efectos: por un lado, el espejo reflejaba la luz emitida al microscopio, lo que aumentaba el brillo de la señal de fluorescencia y, por lo tanto, también la nitidez efectiva de la imagen.
También hay un segundo fenómeno: las ondas de luz emitidas y reflejadas se superponen. Esto crea la llamada interferencia. Dependiendo de la distancia al espejo, la luz se amplifica o atenúa. "De esta manera, vemos principalmente estructurasen cierto plano de la imagen ", dice Heil." Todo lo que está arriba o abajo y que podría perturbar la imagen, por otro lado, está oculto ". Para garantizar que las partes exactas de la imagen se vuelvan visibles, el grosor de la transparenciala capa aplicada al espejo debe elegirse adecuadamente. Entre otras cosas, Heinze y Heil utilizan simulaciones por computadora para adaptar el recubrimiento de acuerdo con el objeto.
En general, el método es sorprendentemente fácil de usar, dice Hannah Heil. "Eso es lo que realmente me gusta de nuestro enfoque". El profesor Heinze agrega: "Excepto por el cubreobjetos recubierto de dieléctrico de metal barato no hay necesidad de ningún microscopio adicionalhardware o software para aumentar la precisión de localización y, por lo tanto, es un complemento fantástico en microscopía avanzada ".
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Materiales proporcionados por Universidad de Würzburg . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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