Los ingenieros biomédicos de la Universidad de Duke han utilizado una técnica de ingeniería genética CRISPR / Cas9 para desactivar un gen que regula los niveles de colesterol en ratones adultos, lo que lleva a niveles reducidos de colesterol en sangre y represión genética que dura seis meses después de un solo tratamiento.
Esta es la primera vez que los investigadores entregan represores CRISPR / Cas9 para el silenciamiento de genes terapéuticos dirigidos en modelos animales adultos. El estudio apareció en línea en Comunicaciones de la naturaleza el 26 de abril
El sistema CRISPR / Cas9 se basa en un mecanismo de defensa antiviral en bacterias en el que la enzima Cas9 reconoce las secuencias de ADN viral de infecciones previas y corta el ADN invasor durante la reinfección. Los investigadores han diseñado el sistema CRISPR / Cas9 para no sololocalizar y cortar secuencias específicas de ADN, pero también activar o desactivar la expresión de genes específicos sin realizar cambios permanentes en la secuencia de codificación del ADN.
Si bien esta técnica represora CRISPR / Cas9 ha surgido como una herramienta sólida para interrumpir la regulación génica en modelos de cultivo celular, aún no se había adaptado para su administración a animales adultos para aplicaciones como la terapia génica.
En su estudio más reciente, Charles Gersbach, profesor asociado de ingeniería biomédica de la familia Rooney en Duke, y miembros de su laboratorio desarrollaron un enfoque para empaquetar y entregar de manera eficiente el sistema represor CRISPR / Cas9 a ratones. Probaron su sistema de administración mediantesilenciar Pcsk9, un gen que regula los niveles de colesterol. Si bien se han desarrollado varios medicamentos para tratar el colesterol alto y las enfermedades cardiovasculares al bloquear la actividad de Pcsk9, este nuevo enfoque evitaría la producción de Pcsk9.
"Anteriormente usamos estos mismos tipos de herramientas para activar y desactivar genes en células cultivadas, y queríamos ver si también podíamos entregarlos a modelos animales con un enfoque que sea relevante para la terapia génica", dijo Gersbach.Queríamos cambiar los genes de una manera que tuviera un resultado terapéutico, y Pcsk9 es una prueba de concepto útil dado su papel en la regulación de los niveles de colesterol, que a su vez afectan problemas de salud como enfermedades cardíacas ".
Para probar el represor Pcsk9 dirigido en un animal adulto, el equipo optó por usar vectores virales adenoasociados AAV, pequeños virus que han sido diseñados para atacar una variedad de tipos de tejidos en ensayos clínicos de terapia génica humana. Debido aEl pequeño límite de carga del vector, el equipo no pudo usar la enzima común Cas9 de Streptococcus pyogenes. En su lugar, optaron por usar un Cas9 más pequeño de Staphylococcus aureus. También desactivaron la función de corte de ADN de Cas9, creando una versión "muerta"de la enzima, dCas9, que se une a la secuencia de ADN objetivo, pero no la corta.
El dCas9 se puede combinar con una proteína KRAB que silencia la expresión génica, creando un represor CRISPR / Cas9 que bloquea la transcripción, reduce la accesibilidad a la cromatina y silencia la expresión génica sin alterar la secuencia de ADN subyacente. Usar un vector de adenovirus para administrar CRISPR / Cas9represores del hígado del ratón, los investigadores redujeron los niveles de Pcsk9 y colesterol en los ratones tratados.
Si bien el experimento fue exitoso, los investigadores también observaron la liberación de enzimas hepáticas en la sangre solo en tratamientos que incluían Cas9. Si bien estos niveles de enzimas hepáticas permanecieron por debajo de un umbral crítico y se normalizaron con el tiempo, sus niveles elevados indicaron que la terapia potencialmente causabarespuestas inmunes en el hígado, donde se acumulan el virus y la enzima Cas9. Eso plantea dudas sobre la eficacia de múltiples inyecciones.
"Una de las cosas interesantes que encontramos parecía una respuesta inmune contra la proteína Cas9", dijo Pratiksha Thakore, la estudiante de doctorado que dirigió el trabajo en el laboratorio de Gersbach. "Después de la inyección, vimos que los niveles de nuestro gen objetivo, Pcsk9, se redujeron, pero también observamos aumentos en la expresión de muchos genes de células inmunes, lo que indica que las células inmunes se estaban infiltrando en el hígado después de que les entregamos Cas9 a los ratones. Será importante comprender mejor esta respuesta inmunitaria y cómo modularlapor usar tecnologías Cas9 para terapias. "
A medida que los investigadores desarrollan nuevas formas de usar CRISPR / Cas9 para terapia e investigación, surge más información sobre cómo el sistema inmunológico de los organismos vivos responde a la administración del sistema CRISPR / Cas9. Debido a que la enzima Cas9 se deriva de bacterias, el sistema inmunológicoEl sistema puede reconocerlo como una proteína extraña de un organismo invasor y generar una respuesta. También existe la preocupación de que los pacientes potenciales para una terapia basada en CRISPR / Cas9 ya estén preparados para albergar respuestas inmunes contra estos sistemas, porque las enzimas Cas9 más comúnmenteutilizados en la investigación provienen de bacterias comunes a las que los humanos están expuestos habitualmente.
"El campo está empezando a ver esto y está claro que la respuesta inmune es un tema importante", dijo Gersbach. "Aunque vimos una respuesta inmune en los ratones cuando administramos Cas9, los niveles de enzimas hepáticas enel suero pareció mitigarse con el tiempo sin ninguna intervención, y el efecto de la represión de Pcsk9 se mantuvo independientemente ".
A medida que continúan la investigación, Gersbach y sus colaboradores esperan recopilar más información para comprender mejor la respuesta inmune contra Cas9 y la estabilidad de la modulación epigenética.
"Todavía hay muchas cosas que explorar con este enfoque", dijo Thakore. Las herramientas CRISPR / Cas9 han funcionado tan bien en modelos de cultivo celular que es emocionante aplicarlas más in vivo, especialmente cuando estamos examinandoobjetivos terapéuticos importantes y el uso de vehículos de administración que serían relevantes para el tratamiento de enfermedades humanas ".
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Materiales proporcionado por Universidad de Duke . Nota: el contenido se puede editar por estilo y longitud.
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