Los científicos de la Universidad de California, Berkeley y el Hospital General de Massachusetts han identificado una región clave dentro de la proteína Cas9 que gobierna con qué precisión CRISPR-Cas9 se ubica en una secuencia de ADN objetivo, y la han modificado para producir un editor de genes hiperprecisocon el nivel más bajo de corte fuera del objetivo hasta la fecha.
El dominio de la proteína que los investigadores identificaron como un controlador maestro de corte de ADN es un objetivo obvio para la reingeniería para mejorar aún más la precisión, dicen los investigadores. Este enfoque debería ayudar a los científicos a personalizar las variantes de Cas9, la proteína que se une y cortaADN: para minimizar la posibilidad de que CRISPR-Cas9 edite el ADN en el lugar equivocado, una consideración clave al hacer terapia génica en humanos.
Una estrategia para lograr una precisión mejorada es crear mutaciones en el dominio proteico gobernante, llamado REC3, y ver cuáles mejoran la precisión sin afectar la eficiencia del corte en el objetivo.
"Hemos encontrado que incluso pequeñas alteraciones en el dominio REC3 de Cas9 afectan el diferencial entre la edición dentro y fuera del objetivo, lo que sugiere que este dominio es un candidato obvio para la mutagénesis en profundidad para mejorar la especificidad de orientación. Como una extensiónde este trabajo, uno podría realizar una mutagénesis más imparcial dentro de REC3 que las mutaciones específicas que hemos realizado ", dijo la coautora Janice Chen, estudiante graduada en el laboratorio de Jennifer Doudna, quien coinventó el gen CRISPR-Cas9.herramienta de edición.
Los coprimeros autores Chen, Yavuz Dagdas y Benjamin Kleinstiver, y sus colegas del UC Berkeley, el Hospital General de Massachusetts y la Universidad de Harvard informan sus resultados en línea antes de su publicación en la revista Naturaleza .
Cas9 hiperprecisa
Desde 2012, cuando Doudna, profesor de biología molecular y celular e investigador del Instituto Médico Howard Hughes en UC Berkeley, y su colega Emmanuelle Charpentier en el Instituto Max Planck de Infección Biológica reutilizaron la proteína Cas9 para crear una proteína barata, precisa y fácil-para usar el editor de genes, los investigadores han tratado de reducir las posibilidades de edición fuera del objetivo. Si bien la fidelidad mejorada beneficia la investigación básica, es absolutamente crítico al editar genes para aplicaciones clínicas, ya que cualquier corte de ADN fuera del objetivo podría deshabilitar genes clave yconducir a efectos secundarios permanentes e inesperados.
En los últimos dos años, dos equipos diseñaron proteínas Cas9 altamente precisas, una especificidad mejorada llamada eSpCas9 1.1 y una de alta fidelidad llamada SpCas9-HF1, y Chen y Doudna buscaron saber por qué cortaron con mayorespecificidad que la proteína Cas9 de tipo salvaje de Streptococcus pyogenes utilizada ampliamente hoy en día.
Actualmente, los investigadores que usan CRISPR-Cas9 crean un ARN de guía única sgRNA, una molécula de ARN que incluye una cadena de 20 ácidos ribonucleicos que complementa una secuencia específica de ADN de 20 ácidos nucleicos que desean atacar, y unira Cas9. Esta guía de ARN le permite a Cas9 concentrarse en el ADN complementario, unirse a él y cortar la hélice bicatenaria. Pero el complejo Cas9-sgRNA también puede unirse al ADN que no coincide exactamente, lo que conduce a un desajuste indeseable.corte objetivo
En 2015, el laboratorio de Doudna descubrió un interruptor conformacional de Cas9 que se activa cuando la guía de ARN y el objetivo de ADN coinciden. Descubrieron que solo cuando el ARN y el ADN coinciden estrechamente la estructura 3D de Cas9, en particular la conformación del HNHdominio de nucleasa, cambiar y activar las tijeras de Cas9. Sin embargo, el proceso responsable de detectar los ácidos nucleicos aguas arriba del interruptor conformacional sigue siendo desconocido.
En el estudio actual, Chen y Dagdas utilizaron una técnica llamada FRET de una sola molécula transferencia de energía de resonancia de Förster para medir con precisión cómo los diversos dominios de proteínas en el complejo proteico Cas9-sgRNA, en particular REC3, REC2 y HNH,moverse cuando el complejo se une al ADN.
Primero determinaron que los beneficios de especificidad conferidos por eSpCas9 1.1 y SpCas9-HF1 podrían explicarse por el hecho de que el umbral para el cambio conformacional HNH era mucho mayor para estas variantes Cas9 que para la proteína Cas9 de tipo salvaje, lo que hace queLas variantes eSpCas9 1.1 y SpCas9-HF1 tienen menos probabilidades de activar las tijeras cuando están unidas a una secuencia fuera del objetivo.
Luego, descubrieron que el dominio REC3 es responsable de detectar la precisión de la unión al objetivo, lo que luego indica la rotación hacia afuera del dominio REC2 para abrir una ruta para el dominio de nucleasa HNH, activando las tijeras. Esta conformación activa de Cas9 esluego capaz de escindir ambas cadenas del ADN objetivo.
Chen, Dagdas y Kleinstiver mostraron que al mutar partes de REC3, es posible cambiar la especificidad de la proteína Cas9 para que la nucleasa HNH no se active a menos que la coincidencia de ARN guía y ADN objetivo esté muy cerca.para diseñar un Cas9 hiperpreciso mejorado, denominado HypaCas9, que conserva su eficiencia dentro del objetivo pero es ligeramente mejor para discriminar entre los sitios dentro y fuera del objetivo en las células humanas.
"Si mutas ciertos residuos de aminoácidos en REC3, puedes ajustar el equilibrio entre la actividad Cas9 en el objetivo y la especificidad mejorada; pudimos encontrar el punto óptimo donde hay suficiente actividad en el objetivo previsto pero también una gran reducciónen eventos fuera del objetivo ", dijo Chen.
Al continuar explorando las relaciones entre la estructura, la función y la dinámica de Cas9, Doudna y su equipo esperan seguir diseñando la proteína con una sensibilidad exquisita para realizar de manera confiable y eficiente una variedad de alteraciones genéticas.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Universidad de California - Berkeley . Original escrito por Robert Sanders. Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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