Un equipo internacional de científicos utilizó por primera vez un láser de rayos X de electrones libres para desentrañar la estructura de una partícula de virus intacta a nivel atómico. El método utilizado reduce drásticamente la cantidad de material viral requerido, al tiempo que permiteLas investigaciones se llevarán a cabo varias veces más rápido que antes. Esto abre nuevas oportunidades de investigación, como informa el equipo de investigación dirigido por el científico de DESY Alke Meents en la revista Métodos de la naturaleza .
En el campo conocido como biología estructural, los científicos examinan la estructura tridimensional de las moléculas biológicas para determinar cómo funcionan. Este conocimiento mejora nuestra comprensión de los procesos biológicos fundamentales que tienen lugar dentro de los organismos, como la forma en quelas sustancias se transportan dentro y fuera de una célula, y también se pueden usar para desarrollar nuevos medicamentos.
"Conocer la estructura tridimensional de una molécula como una proteína proporciona una gran comprensión de su comportamiento biológico", explica el coautor David Stuart, Director de Ciencias de la Vida en la instalación de sincrotrón Diamond Light Source en el Reino Unido y profesor en elUniversidad de Oxford: "Un ejemplo es cómo comprender la estructura de una proteína que un virus usa para 'engancharse' en una célula podría significar que podemos diseñar una defensa para la célula para que el virus sea incapaz de atacarla".
La cristalografía de rayos X es, con mucho, la herramienta más prolífica utilizada por los biólogos estructurales y ya ha revelado las estructuras de miles de moléculas biológicas. Se cultivan pequeños cristales de la proteína de interés y luego se iluminan con rayos X de alta energía.Los cristales difractan los rayos X de manera característica para que los patrones de difracción resultantes puedan usarse para deducir la estructura espacial del cristal, y por lo tanto de sus componentes, en la escala atómica. Sin embargo, los cristales de proteínas no son tan estables.y resistentes como cristales de sal, por ejemplo. Son difíciles de cultivar, a menudo permanecen pequeños y se dañan fácilmente con los rayos X.
"los láseres de rayos X han abierto un nuevo camino a la cristalografía de proteínas, porque sus pulsos extremadamente intensos se pueden usar para analizar incluso cristales extremadamente pequeños que no producirían una imagen de difracción suficientemente brillante usando otras fuentes de rayos X", agrega co-autor Armin Wagner de Diamond Light Source. Sin embargo, cada uno de estos microcristales solo puede producir una única imagen de difracción antes de que se evapore como resultado del pulso de rayos X. Sin embargo, para realizar el análisis estructural, cientos o incluso miles de imágenes de difracciónEn tales experimentos, los científicos inyectan un fino chorro líquido de cristales de proteínas a través de un láser de rayos X pulsado, que libera una secuencia rápida de ráfagas extremadamente cortas. Cada vez que un pulso de rayos X golpea un microcristal, una difracciónla imagen se produce y se graba
Este método es muy exitoso y ya se ha utilizado para determinar la estructura de más de 80 biomoléculas. Sin embargo, la mayor parte del material de muestra se desperdicia. "La tasa de aciertos suele ser inferior al dos por ciento de los pulsos, por lo que la mayoría delos microcristales preciosos terminan sin usarse en el contenedor de recolección ", dice Meents, que se encuentra en el Centro de Ciencia de Láser Libre de Electrones CFEL en Hamburgo, una cooperación de DESY, la Universidad de Hamburgo y la Sociedad Alemana Max Planck. El estándarpor lo tanto, el método generalmente requiere varias horas de tiempo de haz y cantidades significativas de material de muestra.
Para utilizar el tiempo de haz limitado y el material de muestra precioso de manera más eficiente, el equipo desarrolló un nuevo método. Los científicos usan un chip micro-estampado que contiene miles de pequeños poros para contener los cristales de proteínas. El láser de rayos X luego escaneael chip línea por línea, e idealmente esto permite que se grabe una imagen de difracción para cada pulso del láser.
El equipo de investigación probó su método en dos muestras de virus diferentes utilizando el láser de rayos X LCLS en el Laboratorio Nacional Acelerador SLAC en los Estados Unidos, que produce 120 pulsos por segundo. Cargaron su soporte de muestra con una pequeña cantidad de microcristales delenterovirus bovino 2 BEV2, un virus que puede causar abortos espontáneos, mortinatos e infertilidad en el ganado, y que es muy difícil de cristalizar.
En este experimento, los científicos lograron una tasa de aciertos, donde el láser de rayos X apuntó con éxito al cristal, de hasta el nueve por ciento. En solo 14 minutos habían reunido suficientes datos para determinar la estructura correcta del virus- que ya se conocía por experimentos en otras fuentes de luz de rayos X - hasta una escala de 0.23 nanómetros millonésimas de milímetro.
"Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se determina la estructura atómica de una partícula de virus intacta usando un láser de rayos X", señala Meents. "Mientras que los métodos anteriores en otras fuentes de luz de rayos X requeríancristales con un volumen total de 3.5 nanolitros, logramos usar cristales que eran más de diez veces más pequeños, con un volumen total de solo 0.23 nanolitros ".
Este experimento se realizó a temperatura ambiente. Si bien el enfriamiento de los cristales de proteínas los protegería en cierta medida del daño por radiación, esto generalmente no es factible cuando se trabaja con cristales de virus extremadamente sensibles. Sin embargo, los cristales de proteínas de virus aisladas pueden congelarse,y en una segunda prueba, los investigadores estudiaron la polihedrina de la proteína viral que forma un cuerpo de oclusión viral para hasta varios miles de partículas de virus de ciertas especies. Las partículas de virus usan estos contenedores para protegerse contra las influencias ambientales y, por lo tanto, pueden permanecerintacto por tiempos mucho más largos
Para la segunda prueba, el científico cargó su chip con cristales de polihedrina y los examinó usando el láser de rayos X mientras mantenía el chip a temperaturas inferiores a menos 180 grados Celsius. Aquí, los científicos lograron una tasa de éxito de hasta el 90 por ciento. En solo diez minutos habían grabado imágenes de difracción más que suficientes para determinar la estructura de la proteína dentro de 0.24 nanómetros. "Para la estructura de la polihedrina, solo tuvimos que escanear un solo chip que estaba cargado con cuatro microgramos de cristales de proteínas; eso esórdenes de magnitud inferiores a la cantidad que normalmente se necesitaría ", explica Meents.
"Nuestro enfoque no solo reduce el tiempo de recopilación de datos y la cantidad de muestra necesaria, sino que también abre la oportunidad de analizar virus completos con láser de rayos X", resume Meents. Los científicos ahora quieren aumentar la capacidad desu chip por un factor de diez, de 22,500 a unos 200,000 microporos, y aumentar aún más la velocidad de escaneo hasta mil muestras por segundo. Esto explotaría mejor el potencial del nuevo láser de rayos X de electrones libres XFEL europeo, queestá comenzando a funcionar en la región de Hamburgo y podrá producir hasta 27,000 pulsos por segundo. Además, la próxima generación de chips solo expondrá los microporos que se están analizando actualmente, para evitar que los cristales restantes se dañen porradiación dispersa del láser de rayos X.
Investigadores de la Universidad de Oxford, la Universidad del Este de Finlandia, el Instituto Suizo Paul Scherrer, el Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley en los EE. UU. Y SLAC también participaron en la investigación. Los científicos del diamante han colaborado con el equipo de DESY, con muchodel desarrollo y prueba del chip micro-modelado que se realiza en las líneas de luz I02 e I24 de Diamond.
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Materiales proporcionado por DISEÑO Deutsches Elektronen-Synchrotron . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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