Un par de biólogos de plantas en el Instituto de Bio-Moléculas Transformativas ITbM de la Universidad de Nagoya, informó en la revista Fisiología vegetal y celular , sobre el desarrollo de un nuevo vector un portador para transferir información genética para eliminar los genes objetivo en la planta modelo, Arabidopsis thaliana, de una manera altamente eficiente y heredable.
El genoma consiste en el conjunto completo de ADN del organismo, incluidos sus genes, que contiene toda la información necesaria para desarrollar y mantener el organismo. Ingeniería del genoma, que implica la modificación específica de partes del genoma mediante la eliminación, adición y alteración de secciones deLa secuencia de ADN es una técnica de rápido desarrollo. Hasta ahora, el sistema CRISPR Repeticiones Palindrómicas Cortas Intercaladas Regularmente Agrupadas / Cas9 proteína 9 asociada a CRISPR es uno de los métodos más populares para la manipulación genética que surge de su simplicidad, versatilidad yeficiencia.
No obstante, la eficiencia inductora de mutaciones de CRISPR / Cas9 hacia la planta modelo, Arabidopsis thaliana, se ha mantenido algo baja hasta ahora. Esto se debe a que el desencadenante de la mutación genética se activa en las etapas posteriores del desarrollo en las células. Por lo tanto, una cantidad significativa dese ha requerido tiempo, esfuerzo y especies de plantas para obtener las especies de plantas deseadas con el gen objetivo eliminado.
CRISPR / Cas9 consta de 2 moléculas clave, un pedazo de ARN llamado ARN guía gRNA y una enzima llamada Cas9. Cas9 actúa como una tijera molecular que puede cortar ambas cadenas en el ADN en una ubicación específica en el genoma, de modo queLas secuencias de ADN pueden agregarse o eliminarse en esa posición. Por otro lado, el ARNg consiste en una secuencia de ARN prediseñada aproximadamente 20 bases de largo que se encuentra dentro de un andamio de ARN más largo. El andamio de ARN se une al ADN y al presecuencia de ARN diseñada por el usuario guía la proteína Cas9 a la parte específica del genoma, de modo que Cas9 pueda cortar en la posición objetivo.
"Al usar un promotor para un gen de PROTEÍNA RIBOSOMAL S5A RPS5A, que se expresa desde una etapa embrionaria temprana en células vegetales, pudimos inducir a la proteína Cas9 a eliminar genes en células de huevo con alta eficiencia", dice HirokiTsutsui, el primer autor de este estudio. "Este promotor RPS5A está activo en los óvulos y decidimos llamar a esta herramienta molecular, un vector pKAMA-ITACHI Red pKIR, que puede editar el genoma de la planta en alta eficiencia en relación con el 35Spromotor comúnmente utilizado en plantas ", continúa.
'Kama-itachi' tiene el significado japonés de tres criaturas parecidas a comadrejas, donde la primera comadreja apunta y hace tropezar a una persona, seguida por la segunda que hiere a la persona cortándola, y la tercera que cura a la persona.similar al proceso del sistema CRISPR / Cas9 hacia el ADN, donde CRISPR se dirige, Cas9 corta e induce la reparación de la secuencia de ADN específica de interés.
"Al poder eliminar eficazmente el gen objetivo en Arabidopsis thaliana, consideramos que este es un método prometedor para dilucidar las funciones genéticas de las plantas", dice Tetsuya Higashiyama, profesor y líder de esta investigación. "Esperamos que podamospuede aplicar esta metodología para la edición genómica de cultivos, como Brassica napus, para acelerar su crecimiento y generar una variedad de líneas de plantas ".
El sistema CRISPR / Cas9 funciona eliminando un gen específico para investigar su función. En la planta modelo, Arabidopsis thaliana, como la proteína Cas9 se expresa en una etapa posterior del desarrollo de la célula, el grado de desactivación del gen varíasegún el tejido, por lo que la eficiencia de la mutación genómica ha sido relativamente baja.
Por ejemplo, cuando se usó un promotor 35S comúnmente utilizado para plantas para expresar la proteína Cas9 en Arabidopsis thaliana, aunque se observaron frecuentes omisiones de los genes en las hojas, solo se detectaron unas pocas en las flores. Esto sugiere que la mutación inactivadala eficiencia del gen objetivo fue relativamente baja en las células reproductoras de las flores. Posteriormente, la mutación knockout fue difícil de transmitir a las células hijas en la próxima generación.
Para resolver este problema, el grupo de Higashiyama decidió expresar la proteína Cas9 en la célula de huevo y en la célula durante la etapa temprana de desarrollo, con el fin de mejorar la eficiencia de eliminación de los genes.
"Dado que los óvulos y los óvulos fecundados cigotos son el origen del desarrollo y crecimiento de las células vegetales, pensamos que si la edición del genoma se lleva a cabo en una etapa temprana, la mutación genética puede ocurrir con alta eficiencia y puede ser heredada porla próxima generación de células ", explica Tsutsui." El vector pKIR era ideal, ya que puede expresar continuamente la proteína Cas9 durante la etapa de células de huevo y la etapa de desarrollo ".
El equipo primero intentó eliminar el gen PDS3 Phytoene DeSaturase 3, que se sabe que es responsable de la síntesis de clorofila en las plantas. Sin clorofila, la planta se convertirá en una especie albina con una apariencia blanca. Al expresar Cas9Con pKIR, Tsutsui logró observar la desactivación del gen PDS3, indicado por la generación de una planta albina.
Tsutsui también investigó el efecto sobre la cantidad de clorofila sintetizada en el tallo de la flor, cuando el gen PDS3 fue eliminado. Al usar el promotor 35S para expresar Cas9, la cantidad de clorofila fue solo ligeramente diferente a la cantidad observada en eltipo salvaje. Por otro lado, cuando Cas9 fue inducido por pKIR, la cantidad de clorofila disminuyó drásticamente, lo que sugiere que la eliminación del gen se había producido de manera eficiente.
El equipo también descubrió que el vector pKIR elimina con éxito otros genes en Arabidopsis thaliana, como AGAMOUS AG, DUO1 DUO POLLEN 1 y ADH1 ALCOHOL DEHYDROGENASE 1, que están involucrados en el desarrollo de la flor, espermatozoides y una enzima que convierte el alcohol en aldehídos, respectivamente.
AGAMOUS es un factor de transcripción involucrado en el desarrollo de la flor meristemo floral. Tras la desactivación del gen AGAMOUS inducido por pKIR, se observó una flor dentro de una flor, conocida como doble flor. Además, en el experimento de eliminacióndel gen DUO1, que codifica una línea germinal masculina, inducida por pKIR, la división celular de la célula generativa se vio afectada y se observó una célula no fértil similar a los espermatozoides.
El gen ADH1, que codifica una enzima que convierte el alcohol alílico en acroleína un aldehído, también fue eliminado por inducción con pKIR en alta frecuencia. Esta alta frecuencia sugiere que el gen ADH1 fue eliminado en todas las células reproductivasóvulos y espermatozoides en la primera generación. Los mutantes con la desactivación del gen ADH1 pudieron sobrevivir, mientras que las plantas de tipo salvaje y heterocigóticas fueron destruidas debido a la generación de acroleína, que es tóxica para las plantas.
"Dado que todas las especies de la segunda generación mostraron el mismo patrón de mutación, esto indica que la edición del genoma se produjo temprano en la etapa de desarrollo en los óvulos de la primera generación", describe Tsutsui.
Para identificar fácilmente las especies instaladas con genes para CRISPR / Cas9, las semillas que contienen Cas9 están marcadas con fluorescencia roja.
Tsutsui y Higashiyama han encontrado un método eficiente para la edición del genoma de Arabidopsis thaliana, que consiste en expresar Cas9 con un promotor RPS5A vector pKIR que puede eliminar los genes en las células durante una etapa temprana de desarrollo e inducir mutaciones que pueden transmitirsea las células hijas en la próxima generación.
"Este método pKIR nos permite investigar grupos de genes, que pueden tener funciones superpuestas", dice Tsutsui. "Anteriormente, teníamos que hacer múltiples plantas knockout cruzando mutantes existentes para examinar las funciones genéticas superpuestas, lo que llevó tiempo. Deberíamos sercapaz de explorar las funciones de grupos de genes no identificados al poder acceder rápidamente a mutantes mediante nuestro método de costo relativamente bajo ".
"Esperamos poder continuar mejorando este método para aumentar la eficiencia de la mutación, de modo que se convierta en una herramienta útil de ingeniería del genoma para modificar las secuencias de ADN objetivo en varios organismos", dice Higashiyama.
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Materiales proporcionado por Instituto de Bio-Moléculas Transformativas WPI-ITbM, Universidad de Nagoya . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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