Los científicos de la Universidad de California, Berkeley, han desarrollado un método más rápido y eficiente para alterar los genes de los ratones con CRISPR-Cas9, simplificando un procedimiento que crece en popularidad debido a la facilidad de usar la nueva herramienta de edición de genes.
Si bien CRISPR-Cas9 ha llamado la atención mundial debido a su potencial para corregir enfermedades hereditarias simples en humanos, los investigadores básicos están entusiasmados con su capacidad para ayudarlos a comprender las causas y desarrollar tratamientos para enfermedades más complejas, como el cáncer y la demencia.
Para hacer eso, necesitan eliminar o modificar genes específicos en animales de laboratorio, en particular, ratones, y ver qué sale mal. El estándar de oro de hoy para crear estos "knockouts" o "knockins" es editar los genesdentro de las células madre embrionarias de ratón, use estas células para crear ratones mosaicos y luego cruce los ratones para obtener una cepa genética pura. Debido a la capacidad de CRISPR-Cas9 de alterar o reemplazar genes con precisión, la edición se realiza cada vez más directamente en el huevo fertilizadoo embrión temprano.
El nuevo método, llamado CRISPR-EZ electroporación CRISPR RNP de cigotos, hace que la edición del genoma en embriones de ratón sea aún más fácil.
"Las ideas fundamentales clave sobre la importancia biológica de un gen generalmente provienen de estudios de edición de genes in vivo, en los que se generan ratones con un gen alterado", dijo el investigador principal Lin He, profesor asociado de UC Berkeley de molecular y celularbiología ". Pero es un compromiso importante hacer un novedoso golpe de gracia con la ingeniería del genoma. Creo que esta tecnología podría reducir en gran medida la barrera técnica para este tipo de esfuerzo y permitirá a las personas centrarse más en la ciencia en lugar de ser consumidas por el procesode ratones genéticamente modificados ".
El nuevo método, descrito en la edición de esta semana de Revista de Química Biológica , evita un cuello de botella que lleva mucho tiempo al crear ratones knockout: usando agujas microscópicas para inyectar moléculas de edición de genes en un óvulo fertilizado.
Los investigadores de UC Berkeley descubrieron que una técnica de laboratorio simple llamada electroporación funciona mucho mejor, permitiéndoles insertar moléculas de edición de genes CRISPR-Cas9 en embriones con casi un 100 por ciento de éxito. La electroporación utiliza una descarga de electricidad para crear agujeros en los embriones a través dequé moléculas pueden entrar
Utilizando CRISPR-EZ en un experimento piloto, el equipo de He interrumpió con éxito ambas copias de un gen objetivo en el 88 por ciento de los ratones. El procedimiento generó un número mucho mayor de ratones editados en comparación con la microinyección CRISPR, en gran parte debido a una mejora significativa enviabilidad del embrión. CRISPR-EZ es una metodología simple y rentable, y se puede realizar en muchos embriones a la vez y solo lleva milisegundos, dijo.
"En un pasado no muy lejano, costaría al menos $ 25,000 y tomaría al menos 6 meses hacer un ratón knockout", dijo Russell Vance, profesor de biología molecular y celular de UC Berkeley y director del Laboratorio de Investigación del Cáncer,donde se realizó el trabajo del ratón transgénico. "Con CRISPR, y mejoras como CRISPR-EZ, los costos y el tiempo se han reducido al menos 10 veces. Estas innovaciones técnicas hacen que el ratón sea una herramienta aún más poderosa para modelar enfermedades humanas".
El grupo UC Berkeley ahora está trabajando con varias instalaciones de ratones transgénicos con la esperanza de que adopten y mejoren esta técnica de electroporación, que sospecha que también simplificará la creación de otros mamíferos transgénicos.
Knockouts requieren equipo de FIV
La creación de ratones transgénicos requiere un equipo experto en fertilización in vitro. Los técnicos usan inyecciones de hormonas para preparar a las hembras para el apareamiento, después de lo cual cosechan los óvulos fertilizados y, antes de que los huevos comiencen a dividirse, los inyectan uno a la vez con una aguja finaActualmente, los técnicos inyectan dos moléculas de ARN, el ARN mensajero ARNm, que codifica la proteína Cas9, y guían el ARN, que proporciona la dirección del objetivo de CRISPR-Cas9, y esperan que el ARNm se traduzca adecuadamente en la proteína Cas9 yque la proteína se combina correctamente con el ARN guía.
Los embriones diseñados se implantan en un ratón falsamente gestante, donde se gestan durante aproximadamente 20 días antes del nacimiento. Dadas las inevitables muertes de embriones durante la inyección y el fracaso de los embriones para implantarse o llegar a término, la tasa de nacimientos vivos es baja, Él dijo.
"El porcentaje real de nacimientos vivos de embriones inyectados es de alrededor del 10 al 15 por ciento para la mayoría de las instalaciones transgénicas, lo cual es un problema con el procedimiento", dijo. "A veces las personas recolectan más de 100 embriones solo para generar uno o dos ratonescon edición de genes deseable "
La electroporación parece hacer menos daño a los embriones que la microinyección: entre 30 y 50 por ciento de los embriones resultaron en nacimientos vivos.
Aparentemente, también, insertar moléculas CRISPR-Cas9 preensambladas en el óvulo fertilizado es una forma más efectiva de editar genes que inyectar dos moléculas, el ARNm y el ARN guía, y esperar que se autoensamblen correctamente.nacidos vivos, el 88 por ciento de los ratones tenían ambas copias del gen objetivo editado, una tasa de éxito más alta de lo normal para los procedimientos transgénicos, dijo.
Para un procedimiento más complejo, modificando una secuencia corta de ADN dentro de un gen, el método tuvo éxito el 42 por ciento del tiempo en un experimento piloto.
"Con una tasa de éxito tan alta, puede usar esto para probar sus ARN guía muy rápidamente", dijo. "Si su CRISPR-EZ no funciona, no se debe a la entrega; probablemente sea porque su diseño de ARN guíanecesita ser mejorado "
La alta viabilidad embrionaria y la muy alta eficiencia de edición de genes significa que los investigadores necesitan usar menos ratones y pueden realizar varios experimentos transgénicos simultáneamente.
descubrimiento accidental
En su laboratorio, Él estudia pequeños fragmentos de ARN llamados microARN, que modifican cómo se transcribe el ADN y, por lo tanto, controlan procesos importantes dentro de una célula. Algunos tipos de cáncer se han relacionado con problemas con miARN.
Buscando una forma más sencilla de crear ratones transgénicos para estudiar estos procesos reguladores, el compañero postdoctoral Andrew Modzelewski probó la electroporación para ver si podía obtener huevos para absorber más fácilmente el ARNm Cas9 y el ARN guía. A pesar del aparente éxito de otros investigadores conARNm, sus intentos iniciales no tuvieron éxito. Una noche, al encontrarse sin ARNm y sin querer desperdiciar los embriones preparados, tomó prestada la proteína CRISPR-Cas9 de un laboratorio vecino, ensambló complejos RNP y los electoporó en su lugar.
"Ha funcionado como magia desde entonces", dijo. "Nunca pensarías que esto funcionaría, porque Cas9 es una molécula gigantesca. Me sorprendió que una proteína tan enorme pudiera electroporarse de manera eficiente".
Aunque la mayoría de las universidades tienen laboratorios transgénicos donde se realizan microinyecciones, la electroporación simplifica el procedimiento lo suficiente como para que los laboratorios individuales eventualmente lo hagan ellos mismos, predijo.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Universidad de California - Berkeley . Original escrito por Robert Sanders. Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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