Un nuevo microscopio desarrollado en el Campus de Investigación Janelia del Instituto Médico Howard Hughes está brindando a los científicos una visión más clara y completa de los procesos biológicos a medida que se desarrollan en animales vivos. El microscopio produce imágenes de organismos completos, como un pez cebra o un embrión de mosca de la fruta, con una resolución suficiente en las tres dimensiones para que cada célula aparezca como una estructura distinta. Además, lo hace a velocidades lo suficientemente rápidas para observar cómo se mueven las células a medida que un embrión en desarrollo toma forma y para monitorear la actividad cerebral a medida que parpadea a través de los circuitos neuronales.
Casi dos años en desarrollo, el líder del grupo Janelia, Philipp Keller, dice que su equipo ha construido el primer microscopio óptico capaz de obtener imágenes de muestras grandes, no transparentes, con una resolución temporal inferior a un segundo y una resolución espacial subcelular en todas las dimensiones.
Keller y su equipo en Janelia pretenden comprender cómo emerge un sistema nervioso en funcionamiento en un embrión. En los últimos cinco años, han ideado varias tecnologías de imagen que permiten obtener imágenes biológicas grandes a alta velocidad. El más nuevo de su laboratorioEl microscopio, llamado microscopio de hoja de luz IsoView, supera un desafío final: mejorar la resolución espacial, sin sacrificar las características de rendimiento de los microscopios anteriores de su equipo. El microscopio IsoView se describe en un artículo publicado en línea el 26 de octubre de 2015 en la revista Métodos de la naturaleza . La publicación incluye planos completos de construcción para el microscopio y el software de procesamiento de imágenes asociado desarrollado por el equipo de Keller.
En 2012, el equipo de Keller desarrolló el microscopio SiMView, que proporciona imágenes tridimensionales rápidas de muestras grandes. Su laboratorio ha utilizado la tecnología para seguir las células durante días mientras se mueven y se dividen en embriones vivos enteros, y para ver cómo se disparan las neuronas individualesa lo largo de todo un sistema nervioso central. Aún así, las estructuras dentro de las células parecían borrosas juntas, y las células profundas dentro de una muestra no podían verse bien en absoluto.
"Teníamos microscopios decentes para el tipo de imágenes que hacemos: imágenes rápidas de la dinámica celular en muestras grandes y vivas. La resolución temporal coincidía con las escalas temporales de los procesos que estamos viendo, y teníamos microscopios que podían proporcionarnos da una buena cobertura y nos permite obtener imágenes durante mucho tiempo sin perturbar el sistema ", dice Keller." Pero hasta la fecha no habíamos tratado de impulsar la resolución espacial en nuestros microscopios ".
Los científicos han encontrado formas de solucionar este problema, y varias nuevas tecnologías de imágenes producen imágenes tridimensionales asombrosamente detalladas. Pero ninguna de esas tecnologías combina una alta resolución espacial con las otras características que Keller necesitaba para sus experimentos. "Estábamos tratando de abordar estoproblema clave de una manera que no nos cuesta en ninguna de las otras categorías que nos interesan. Necesitamos una alta resolución en las tres dimensiones sin comprometer la cobertura o la velocidad ".
En lugar de recolectar una sola imagen de una muestra con un solo objetivo, el nuevo microscopio recolecta simultáneamente luz y crea imágenes desde múltiples ángulos. Cada imagen aún sufre de baja resolución a lo largo de un eje, pero los datos más útiles de cada imagen pueden sercombinado para generar una imagen final con buena resolución en todas las dimensiones.
Keller y un investigador postdoctoral en su laboratorio, Raghav Chhetri, diseñaron un microscopio con cuatro lentes objetivas colocadas alrededor de la muestra en ángulo recto entre sí, como semáforos en una intersección. Cada objetivo envía luz a la muestra para iluminarla,y también recoge la luz fluorescente emitida por la muestra.
De cada lado, un objetivo produce un delgado haz de luz que barre la muestra de arriba hacia abajo tan rápidamente que la cámara de detección frente a ella ve una lámina de luz continua. Los haces de cada uno de los cuatro objetivos se escalonan de manera queno interfieren ni se cruzan entre sí, y un obturador en cada cámara mantiene el ritmo del haz, de modo que el detector de la cámara permanece enfocado en la ranura estrecha a lo largo de la cual puede recoger información de alta resolución. Estas características permiten que el microscopiopara recopilar cuatro imágenes diferentes de la muestra desde diferentes ángulos simultáneamente, sin ninguna diafonía entre estas vistas múltiples.
Chhetri dice que el diseño parecía sencillo, hasta que buscó las piezas que necesitaba para construirlo. Para mantener la velocidad de imagen, la cobertura y la resolución que el equipo quería, los cuatro objetivos del microscopio debían encajar estrechamente con suficiente espacio paramueva durante la captura de imágenes, pero sea lo suficientemente grande como para generar imágenes de grandes campos de visión con buena resolución espacial. Ningún objetivo comercialmente disponible satisfizo estas necesidades.
Keller dice que comprometerse en cualquiera de sus parámetros no era una opción. "No estamos solo en demostraciones de prueba de principio. Si construimos un microscopio de este tipo, deberíamos poder darle un buen uso en el estudio del desarrolloy procesos funcionales "
"Con todos estos criterios estrictos, decidimos que necesitábamos un diseño personalizado", dice Chhetri. Así que el equipo diseñó las piezas precisas que necesitaba y esperó alrededor de 9 meses para que se construyeran a medida. Una vez que las piezas estaban en su lugar, Chhetri dice, sabía que IsoView iba a funcionar.
El paso final fue desarrollar un marco computacional para aprovechar al máximo los datos recopilados por IsoView. Cada una de las cuatro cámaras en el microscopio recopila datos para una imagen que, por sí misma, aún carece de una buena resolución espacial en una dimensión "."No tenemos una imagen de alta resolución que salga directamente del microscopio", explica Keller. "Todavía son estas cuatro imágenes de calidad relativamente baja".
El informático Fernando Amat desarrolló un software de procesamiento de imágenes para transformar esas imágenes en una imagen final de alta resolución. Keller señala que no había ningún software disponible que pudiera hacer el trabajo; requería desarrollar un paquete de software completamente nuevo que pudiera acelerar la imagen-procesamiento de estrategias por más de 60 veces. Un experimento típico con este microscopio podría funcionar durante una hora. Durante ese tiempo, las cuatro cámaras sCMOS en el microscopio pueden transmitir datos del experimento a velocidades de hasta 3.2 gigabytes por segundo. Esto resultaen aproximadamente 10 terabytes de datos de imágenes de múltiples vistas de una hora de imágenes.
Con los nuevos algoritmos, un conjunto de datos IsoView puede procesarse en aproximadamente dos días con una sola estación de trabajo. "Una vez que hayamos registrado y desconvolucionado las imágenes, obtenemos una versión muy nítida de los datos", dice Keller. "Puedemire la pila de imágenes desde cualquier dirección, y no tiene ninguna diferencia percibida en la resolución o nitidez de la imagen ".
Keller y sus colegas han utilizado IsoView para visualizar la actividad célula por célula en todo el sistema nervioso de una larva de mosca de la fruta viva entera, un organismo que tiene más de 10,000 neuronas y es aproximadamente 50 veces más grande que el gusano redondo C. elegans, el único animal cuyo sistema nervioso completo ha sido previamente fotografiado a nivel de una sola célula. Debido a que IsoView puede producir imágenes a medida que las larvas se mueven libremente en un gel suelto, Keller dice, "esto abre la posibilidad de imágenes funcionales en un todo, comportamiento animal. Incluso es posible realizar imágenes funcionales de alta velocidad en escalas de tiempo de desarrollo, como demostramos en la imagen de un embrión de mosca de la fruta que se convierte en una larva ".
Los científicos también realizaron imágenes funcionales de alta resolución de la actividad en todo el cerebro de un pez cebra larval, demostrando que las neuronas en las regiones más profundas y menos accesibles del cerebro podían verse claramente, separadas de sus vecinos. Finalmente, utilizaron elIsoView para rastrear células en un embrión de mosca de la fruta en desarrollo. Un modo de imagen multicolor mejoró la información presentada en los videos resultantes al detectar diferentes etiquetas fluorescentes en las membranas y núcleos de las células.
El equipo planea continuar mejorando la tecnología IsoView, pero Keller también está ansioso por comenzar a usarla para experimentos biológicos. "En este momento es nuestro microscopio más avanzado para la obtención de imágenes, y ciertamente vamos a aprovecharlo", dice..
Fuente de la historia :
Materiales proporcionados por Instituto Médico Howard Hughes . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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